以下文章來(lái)源于一麥眾承 ，作者倪永靜
作者簡(jiǎn)介：
倪永靜，1983年，2010年畢業(yè)于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，作物遺傳育種專(zhuān)業(yè)。2010年7月——至今，在商丘市農(nóng)林科學(xué)院小麥研究所工作，從事小麥常規(guī)育種和遺傳育種。與河南農(nóng)業(yè)大學(xué)合作選育的小麥新品種“尚農(nóng)6”“尚農(nóng)8”于2022年6月通過(guò)河南省主要農(nóng)作物審定委員會(huì)審定。另外在試品種7個(gè)。
1創(chuàng)建小麥突變體庫(kù)
選用均勻一致的國(guó)麥301種子1kg，首先在冷水中浸泡4小時(shí)，然后用0.4%（v/v）EMS溶液在0℃處理種子2小時(shí)，接著在20℃處理14小時(shí)。排干EMS溶液，在流水中沖洗4個(gè)小時(shí)，晾干后種植于商丘市農(nóng)林科學(xué)院雙八試驗(yàn)基地。M?代種子于2012年10月單粒播種，行距0.23m，株距0.08m，按單穗收獲（即M?種子）；M?種子于2013年10月種穗行，行距0.23m，株距0.08m。M?、M?均以未處理的國(guó)麥301為對(duì)照。田間管理按一般試驗(yàn)田進(jìn)行。
每7~10d田間調(diào)查一次，觀察記載幼苗、葉形、莖、分蘗、穗部、育性等性狀，篩選各種表型突變體。變異穗系全部單株收獲脫粒后，觀察記載籽粒形狀、大小、顏色等性狀。
對(duì)M? 12020個(gè)穗系的主要農(nóng)藝性狀及其他生物學(xué)性狀進(jìn)行調(diào)查，共獲得769個(gè)突變體系。其中，5個(gè)苗期致死、109個(gè)株高突變、177個(gè)葉片性狀突變（幼苗期、成株期）、82個(gè)穗部性狀突變、18個(gè)成熟期發(fā)生突變，64個(gè)分蘗突變，45個(gè)不育突變，52個(gè)籽粒突變，217個(gè)其他性狀的突變。M?中發(fā)生表型突變的頻率約為6.398%。具體突變類(lèi)型如表1，部分突變體類(lèi)型展示如圖1。
表1 EMS 誘變小麥新品種國(guó)麥301 M?田間突變類(lèi)型
圖1部分突變體類(lèi)型
2 矮化獨(dú)稈突變體dmc的生物學(xué)特征及遺傳分析
?2.1獨(dú)稈突變體的獲得及其生物學(xué)特征
通過(guò)連續(xù)單株選擇，獲得了1個(gè)不分蘗突變體dmc純合株系。該突變體完全不分蘗，只有一個(gè)主莖（圖2-A），個(gè)別植株偶爾會(huì)有1個(gè)小分蘗。2016-2017年大田突變體株系dmc平均分蘗1.11個(gè)，突變親本國(guó)麥301平均分蘗21.73個(gè)。突變體dmc植株明顯矮小，株高48.00cm，是突變親本國(guó)麥301的74.53%（圖2-A）。進(jìn)一步對(duì)比發(fā)現(xiàn)，突變體dmc只有4個(gè)節(jié)間，比國(guó)麥301少了一個(gè)節(jié)間，與突變親本國(guó)麥301相比，突變體dmc各節(jié)間長(zhǎng)度（倒Ⅰ-倒Ⅳ）均縮短（圖2-F）；而且突變體dmc倒Ⅰ節(jié)間的直徑比國(guó)麥301要小（圖2-E）。
圖2 突變體dmc和國(guó)麥301主要農(nóng)藝性狀比較
A: 抽穗期突變體dmc（右）與國(guó)麥301（左）植株對(duì)比，B: 突變體dmc（右）和國(guó)麥301（左）穗部對(duì)比，C: 灌漿期突變體dmc（右）和國(guó)麥301（左）籽粒對(duì)比，D: 蠟熟期突變體dmc（右）和國(guó)麥301（左）籽粒對(duì)比，E: 突變體dmc（下）和國(guó)麥301（上）倒1節(jié)間直徑對(duì)比，F(xiàn): 突變體dmc（右）和國(guó)麥301（左）節(jié)間對(duì)比。
?2.2 遺傳背景檢測(cè)
利用 SSR標(biāo)記對(duì)突變親本國(guó)麥301與突變體dmc的遺傳背景進(jìn)行檢測(cè)比較，結(jié)果顯示分布在42條染色體上的431個(gè)SSR標(biāo)記擴(kuò)增位點(diǎn)均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)差異性條帶，表明突變親本國(guó)麥301與dmc的遺傳背景高度一致。這個(gè)結(jié)果證明突變體dmc是由國(guó)麥301誘變而來(lái)的。
M: 分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL100）；泳道1-3：國(guó)麥301，泳道4-6：突變體dmc，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶下是SSR引物名稱(chēng)
圖3 SSR標(biāo)記檢測(cè)
?2.3 國(guó)麥301和突變體dmc的組織學(xué)觀察
通過(guò)比較不分蘗突變體dmc和野生型對(duì)照國(guó)麥301的分蘗形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)dmc中主莖基部的分蘗分化和發(fā)育都受到嚴(yán)重抑制（圖4A-E）。在兩葉期，dmc和國(guó)麥301在外部形態(tài)上幾乎沒(méi)有差異。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，國(guó)麥301的分蘗原基已經(jīng)開(kāi)始分化（圖4F），但在dmc中未觀察到分蘗原基（圖4A）。在三葉期，國(guó)麥301的分蘗芽開(kāi)始生長(zhǎng)，在主莖基部形成兩個(gè)一級(jí)分蘗（圖4G），而在dmc基部?jī)H形成一個(gè)微小的突起（圖4B）。在四葉期，國(guó)麥301的主莖變長(zhǎng)且增厚，分蘗原基增多（圖4H，圖5A）。同時(shí)期的dmc的主莖也伸長(zhǎng)，可以觀察到一個(gè)微小的分蘗原基在基部（圖4C）。在越冬期，dmc平均株高（在自然狀態(tài)下的最高離地高度）僅為12cm，是國(guó)麥301平均株高的一半（圖5B）。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)在dmc基部只有兩個(gè)小分蘗原基（圖4D），但國(guó)麥301處于分蘗旺盛期，分蘗數(shù)約為12-14個(gè)，分蘗主要由一級(jí)分蘗和二級(jí)分蘗組成（圖4I）。在起身到拔節(jié)階段，dmc的分蘗幾乎與前期一樣很小（圖4E）。然而，國(guó)麥301的分蘗數(shù)已達(dá)到最大值（圖4J, 圖5C）。大多數(shù)dmc最終只有一個(gè)主莖（圖5C）。
圖4 矮化不分蘗小麥突變體dmc和國(guó)麥301的分蘗組織顯微觀察
（A、B、C、D、E：二葉期、三葉期、四葉期、越冬期和起身到拔節(jié)期之間的dmc；F、G、H、I：二葉期、三葉期、四葉期和越冬期的國(guó)麥301；J：起身到拔節(jié)期之間的國(guó)麥301的部分分蘗芽。MC：主莖；TP：分蘗原基；PT：一級(jí)分蘗；ST：二級(jí)分蘗。A-H，比例尺=1 mm；I和J，比例尺=1cm。）
?2.4 國(guó)麥301和突變體dmc的組織化學(xué)觀察
在組織化學(xué)水平上，三葉期突變體dmc的分蘗原基與國(guó)麥301的分蘗原基有明顯區(qū)別。dmc中通常只有一個(gè)小的分蘗突起，被染成淡黃紫色；相反，國(guó)麥301通常有兩個(gè)分蘗芽，里面包裹著分蘗原基，被染成深黃色。這些表型說(shuō)明國(guó)麥301的分蘗原基蛋白質(zhì)含量明顯高于dmc。此外，在國(guó)麥301的橫切面上，有兩個(gè)明顯的黃色區(qū)域，即旺盛分蘗的原基部位。國(guó)麥301分蘗原基細(xì)胞排列整齊，胞質(zhì)致密被染成深黃色，呈現(xiàn)典型的分生組織特征。然而，在dmc橫切面中通常看不到分蘗原基及分生組織?？傊?，dmc分蘗原基少且分蘗原基蛋白質(zhì)含量低于對(duì)照國(guó)麥301（如圖4）。
（A：dmc（箭頭）分蘗的縱切面；B：國(guó)麥301（箭頭）分蘗的縱切面；C：dmc分蘗基部的橫切面；D：國(guó)麥301分蘗基部的橫切面；E：C的放大圖；F：D的放大圖。TP：分蘗原基；TB：分蘗芽。
圖5 三葉期的國(guó)麥301和dmc小麥分蘗中淀粉（紫色）和蛋白質(zhì)（黃色）的分布
?2.5 突變體dmc遺傳學(xué)初步分析
突變體dmc與中國(guó)春進(jìn)行雜交，對(duì)F?進(jìn)行性狀調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)F?分蘗均減少，平均分蘗4.48個(gè)，而F?株高介于兩親本之間。初步推測(cè)突變體dmc的獨(dú)稈性狀可能是由顯性或半顯性基因控制。
表2 突變體dmc、中國(guó)春及其F1代的株高和分蘗性
3 小麥提前終止穗分化突變體ptsd1遺傳調(diào)控機(jī)制研究
?3.1突變體ptsd1表型分析
突變體ptsd1的平均株高和穗長(zhǎng)分別為50.75cm和4.19cm，與親本國(guó)麥301相比分別降低了21.1%和縮短了60.0%。突變體ptsd1的平均可育小穗數(shù)和單穗籽粒數(shù)為4.50和14.16，與親本國(guó)麥301相比分別減少了77.5%和77.9%。千粒重相比于親本降低了19.8%。突變體ptsd1的抽穗期、開(kāi)花期和成熟期分別推遲了9天、9天和11天。突變體ptsd1主要影響穗長(zhǎng)和小穗數(shù)性狀（圖6）。
圖6 對(duì)照國(guó)麥301和突變體ptsd1整株表型（A）和穗部表型（B）
?3.2 突變體ptsd1幼穗分化的超微結(jié)構(gòu)
對(duì)照國(guó)麥301頂端小穗形成期幼穗超微結(jié)構(gòu)顯示（圖8A），頂端分生組織（im）分化形成最后幾個(gè)頂端小穗原基，上部小穗原基已經(jīng)分化形成護(hù)穎原基、外稃原基和小花原基凸起，中部小穗中的小花原基已經(jīng)分化形成三個(gè)雄蕊原基凸起（stp）和一個(gè)雌蕊原基凸起（pip）。突變體ptsd1只有約5個(gè)小穗原基正常分化（圖8B），小穗中的小花原基分化形成三個(gè)雄蕊原基凸起（stp）和一個(gè)雌蕊原基凸起（pip），而上部小穗原基停止分化，最終形成一個(gè)個(gè)凸起狀結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)越冬期，頂端分生組織逐漸從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段向生殖生長(zhǎng)階段過(guò)渡，頂端圓錐體迅速伸長(zhǎng)（圖7 A、A'）；在二棱期（圖7 B、B'），對(duì)照國(guó)麥301和突變體ptsd1在都形成小穗脊（spr）結(jié)構(gòu)；在二棱后期（圖7 C、C'），對(duì)照的穗軸兩側(cè)小穗原基（spp）逐漸開(kāi)始膨大，首先觀察到中部小穗原基的膨大，然后向頂端和基部延伸，而突變體ptsd1的上部小穗原基停止分化，下部小穗原基逐漸開(kāi)始膨大；在護(hù)穎原基形成期（圖7 D、D'），對(duì)照護(hù)穎原基（glp）逐漸形成，大約形成12 ~ 14個(gè)小穗原基，而突變體ptsd1只形成6 ~ 8個(gè)小穗原基；在外稃原基形成期（圖7E、E'），對(duì)照在護(hù)穎原基上方形成了外稃原基（lemp），大約形成14 ~ 16個(gè)小穗原基，而突變體ptsd1只形成6 ~ 8個(gè)小穗原基，上部小穗原基仍停留在二棱期；在小花原基形成期（圖7 F、F'），中部小穗的第一個(gè)小花原基（flp）分化形成，小花原基位于外稃原基上方，呈半球狀，大約形成16 ~ 18個(gè)小穗原基，而突變體ptsd1只形成6 ~ 8個(gè)小穗原基，上部小穗原基仍停留在二棱期；在頂端小穗形成期（圖7 G、G'），在這個(gè)時(shí)期對(duì)照除了最后幾個(gè)頂端小穗原基分化外，不再形成新的小穗原基，而突變體ptsd1上部小穗原基仍停留在二棱期；在小穗原基分化結(jié)束后，對(duì)照小花原基逐漸開(kāi)始分化最終形成雌蕊和雄蕊（圖7H、I、J和K），突變體ptsd1下部小花原基正常分化形成雌蕊和雄蕊，而突變體ptsd1上部未分化的小穗原基沒(méi)有分化形成小花原基及隨后的雌雄蕊（圖7 H'、I'、J'和K'）。在綠色花藥時(shí)期，對(duì)照國(guó)麥301的上、中和下部小穗中均觀察到正常的雌雄蕊形態(tài)（圖7 L、M和N），而突變體ptsd1上部小穗原基未分化沒(méi)有形成雌雄蕊（圖7L'），突變體ptsd1的中部和下部小穗中均觀察到正常的雌雄蕊形態(tài)（圖7M'和N'）。觀察記錄穗發(fā)育時(shí)期發(fā)現(xiàn)，突變體ptsd1頂端圓錐體比囯麥301晚11天進(jìn)入二棱期，且整個(gè)穗分化進(jìn)程延遲了11天。
圖7 對(duì)照國(guó)麥301（A-N）和突變體ptsd1（A'-N'）的穗分化不同時(shí)期形態(tài)
注：A：二棱初期，B：二棱期，C：二棱后期，D：護(hù)穎原基形成期，E：外稃原基形成期，F(xiàn)：小花原基形成期，G：頂端小穗形成期，H：雌雄蕊原基分化期，I：雌雄蕊原基分化末期，J：外稃完全包裹基部?jī)蓚€(gè)小花，K：綠色花藥時(shí)期，L-N：綠色花藥時(shí)期對(duì)照國(guó)麥301的上、中和下部雌雄蕊形態(tài)。A'-N': 突變體ptsd1與對(duì)照發(fā)育時(shí)期一一對(duì)應(yīng)。spr，小穗脊；spp，小穗原基；spd，小穗分生組織的圓頂；glp，護(hù)穎原基；lemp，外稃原基；flp，小花原基；ts，頂部小穗；an，花藥。紅色括號(hào)標(biāo)注的是從二棱期開(kāi)始突變體ptsd1上部小穗原基不分化。小麥穗發(fā)育時(shí)期參考文獻(xiàn)。
注：Im，花序分生組織；stp，雄蕊原基；pip，雌蕊原基
圖8 對(duì)照國(guó)麥301（A）和突變體ptsd1（B）頂端小穗形成期幼穗超微結(jié)構(gòu)
?3.3 遺傳分析
突變體ptsd1與周麥18雜交組合，正反交F?穗長(zhǎng)正常（圖9A-D），表明控制穗長(zhǎng)性狀位點(diǎn)為隱性基因。“ptsd1 × 周麥18”雜交F?，穗長(zhǎng)性狀分離為三種表型，正常穗（NSL）、中等縮短穗（MSL）和極端縮短穗（ESL）。其中，正常穗的長(zhǎng)度與親本周麥18穗長(zhǎng)相當(dāng)，中等縮短穗的長(zhǎng)度介于周麥18和突變體ptsd1之間，極端縮短穗的長(zhǎng)度與突變體ptsd1相當(dāng)。統(tǒng)計(jì)595個(gè)F?單株穗長(zhǎng)表型發(fā)現(xiàn)，正常穗、中等縮短穗和極端縮短穗分別為503、68和24個(gè)單株（表3）。假設(shè)穗長(zhǎng)由一對(duì)隱性基因控制，統(tǒng)計(jì)正常穗和中等縮短穗（NSL和MSL）為571株，極端縮短穗（ESL）為92株，χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示χ2 ＞ P0.05，不符合孟德?tīng)枂位蜻z傳3:1的分離比，因此突變體ptsd1不是單基因隱性遺傳。假設(shè)穗長(zhǎng)由兩對(duì)隱性基因控制，χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示χ2 ＞ P0.05，不符合15:1的分離比，因此突變體ptsd1也不符合孟德?tīng)杻蓪?duì)獨(dú)立的隱性基因遺傳。
圖9 對(duì)照國(guó)麥301（A）、突變體ptsd1（B）、周麥18（C）、ptsd1與周麥18正反交F?（D）以及后代F?或F2:3穗部形態(tài)（E-H）。
表3 F?群體穗長(zhǎng)性狀遺傳分析
?3.4 結(jié)論
周麥18和中國(guó)春分別與突變體ptsd1雜交，F(xiàn)?穗型都正常，表明ptsd1控制穗長(zhǎng)性狀是由隱性基因控制的。在F?和F2∶3群體中，正常和突變植株的分離比不符合經(jīng)典孟德?tīng)栠z傳學(xué)的1對(duì)隱性基因或2對(duì)獨(dú)立分配、自由重組的隱性基因遺傳的理論分離比。表明突變體ptsd1中，穗長(zhǎng)性狀不是由一對(duì)隱性基因也不是由兩對(duì)獨(dú)立遺傳隱性基因控制。660K芯片SNP標(biāo)記連鎖分析和SSR標(biāo)記連鎖分析表明，在5A染色體的短臂和長(zhǎng)臂上各有一個(gè)突變位點(diǎn)。因?yàn)檫@兩個(gè)突變位點(diǎn)在同一條染色體上，存在基因連鎖，所以遺傳分離比不符合15:1。為此，ptsd1是首次發(fā)現(xiàn)的在5A染色體上同時(shí)存在兩個(gè)基因控制穗分化的突變體。未來(lái)，我們將把這兩個(gè)基因分解到不同的作圖群體中，從而對(duì)每個(gè)基因進(jìn)行圖位克隆。
基于目前的研究結(jié)果，構(gòu)建了突變體ptsd1的遺傳模型（圖10）。將兩對(duì)基因的四種基因型分別用A、a、B和b代替，如A：Ptsd1-5AS，a：ptsd1-5AS，B：Ptsd1-5AL和b：ptsd1-5AL。突變體ptsd1攜帶兩對(duì)隱性基因aabb，正常穗長(zhǎng)植株攜帶兩對(duì)顯性基因AABB，雜交F?基因型為AaBb。F?自交兩代，在F2∶3篩選穗長(zhǎng)分離的家系。根據(jù)F2∶4的分離情況，確定F2∶3家系單株是否純合。篩選純和的正常穗基因型AABB和極端縮短穗基因型aabb純合株系構(gòu)建BSA混池，本研究篩選獲得的連鎖標(biāo)記都是基于這兩個(gè)混池。
將兩個(gè)基因分解到兩個(gè)遺傳群體的方法有以下兩種：
1）篩選穗長(zhǎng)性狀分離的雜合F2∶3植株，根據(jù)連鎖標(biāo)記鑒定F2∶3中基因型為aaBb和Aabb的單株，自交一代得到F2∶4家系群體為一個(gè)基因純合，另一個(gè)基因分離的遺傳群體；
2）篩選穗長(zhǎng)性狀不分離的純合F2∶3植株，根據(jù)連鎖標(biāo)記鑒定F2∶3中基因型為aaBB和AAbb的單株，與突變體ptsd1回交一代得到基因型為aaBb和Aabb的單株，自交后獲得單個(gè)基因的遺傳群體。
圖10 突變體ptsd1的遺傳模型
來(lái)源：一麥眾承
