以下文章來源于南北學(xué)苑 ，作者王鳳格
是誰出的題那么的難，到處都是正確的答案。- 何勇《鐘鼓樓》
我自 2001 年參加工作以來，一直致力于分子技術(shù)在種子質(zhì)量檢測及輔助育種中的應(yīng)用研究，特別是品種真實(shí)性和純度鑒定方面。前年在群里曾分享了關(guān)于品種純度鑒定的一些思考，一直想再對品種真實(shí)性鑒定進(jìn)行思考、總結(jié)并分享，只是內(nèi)容涉及較多，還沒有學(xué)會如何系統(tǒng)化整理。這次下定決心，努力嘗試一下，希望對各位同行有一定的啟發(fā)作用。
有人說，純度是世界性的研究需求，而真實(shí)性是中國特色的研究需求，認(rèn)為中國種業(yè)的大環(huán)境催生了品種真實(shí)性問題。這個(gè)認(rèn)識顯然并不客觀。其實(shí)，真實(shí)性與純度一樣，也是世界性的需求，只是不同國家、不同發(fā)展階段的需求有多少的問題，但并不是中國特色，不研究不意味著沒有需求。我國用 20 多年的時(shí)間，逐步建立起成熟的品種真實(shí)性分子鑒定體系，為我國種業(yè)健康發(fā)展起到了保駕護(hù)航的作用，也為其他國家的品種真實(shí)性管理提供了成熟經(jīng)驗(yàn)。
簡單回顧一下我國在玉米品種真實(shí)性分子鑒定上的發(fā)展歷程：
在技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化方面：2007年，在對 SSR 技術(shù)不斷優(yōu)化完善的基礎(chǔ)上，在玉米上頒布實(shí)施了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR 分子標(biāo)記法》（NY/T1432-2007），該標(biāo)準(zhǔn)成為司法鑒定中應(yīng)用最多的作物分子鑒定標(biāo)準(zhǔn)；該標(biāo)準(zhǔn)于 2014 年進(jìn)行修訂，將高效毛細(xì)管電泳技術(shù)納入到標(biāo)準(zhǔn)中。2014 年，借鑒國際 UPOV-BMT 測試指南并結(jié)合玉米等分子標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用實(shí)踐，制定并頒布了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《植物品種鑒定 DNA 指紋方法總則》（NY/T2594-2014），總則的實(shí)施推動了其它幾十種農(nóng)作物的分子鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程。2022 年，隨著 SNP 新型分子技術(shù)的成熟完善，頒布了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SNP 分子標(biāo)記法》（NY/T4022-2021）。
在玉米品種 DNA 指紋庫構(gòu)建方面：2005 年農(nóng)業(yè)部開始玉米區(qū)試標(biāo)準(zhǔn)樣品保藏；2010年啟動玉米、水稻、小麥、棉花、大豆、油菜六大主要農(nóng)作物審定品種標(biāo)準(zhǔn)樣品征集，收集樣品 1.4 萬份；2015 年農(nóng)業(yè)部發(fā)布“農(nóng)作物品種 DNA 身份鑒定體系構(gòu)建”方案，由北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心作為技術(shù)牽頭單位，聯(lián)合水稻、小麥、棉花等主要農(nóng)作物研究單位，建立基于 SSR 標(biāo)記的主要農(nóng)作物品種標(biāo)準(zhǔn) DNA 指紋庫；2016 年啟動科技部國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“主要農(nóng)作物種子分子指紋檢測技術(shù)研究與應(yīng)用”，由北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心作為項(xiàng)目主持單位，構(gòu)建了基于 SNP 標(biāo)記的、庫容 5萬份以上的七大作物 DNA 指紋庫。
在應(yīng)用領(lǐng)域方面：2002 年起在國家級區(qū)域試驗(yàn)中開始利用DNA指紋技術(shù)進(jìn)行玉米區(qū)試組合的真實(shí)性與一致性檢測，并逐步從普通玉米擴(kuò)展到鮮食玉米、青貯玉米，從玉米擴(kuò)展到小麥、水稻等其它主要農(nóng)作物，從國家級試驗(yàn)擴(kuò)展到省級試驗(yàn)。2004 年起在玉米品種權(quán)保護(hù) DUS 測試中開始探索輔助篩查近似品種，并逐步啟動品種權(quán)保護(hù)樣品建庫。2010 年起在玉米種子質(zhì)量監(jiān)督抽查及種子執(zhí)法中開始啟動大規(guī)模真實(shí)性分子鑒定，包括春季市場抽查、夏季基地巡查、冬季企業(yè)督查等。
在政策法規(guī)方面：2005 年起在玉米國家區(qū)試中試行《國家玉米品種試驗(yàn) DNA 指紋鑒定管理辦法》，對同一品種不同試驗(yàn)?zāi)攴莼蛟囼?yàn)組別的樣品遺傳差異大的（差異位點(diǎn)≥2）停止試驗(yàn)，試驗(yàn)品種與已知品種相同或高度近似的（差異位點(diǎn)≤1）停止試驗(yàn)。2016 年新種子法中將 DNA 等快速檢測結(jié)果列為執(zhí)法依據(jù)，推動了 DNA 指紋技術(shù)在企業(yè)維權(quán)和司法鑒定中的應(yīng)用。2022 年新修訂的國家級玉米品種審定辦法，將審定品種與已知品種的差異位點(diǎn)數(shù)由 2 個(gè)提高到 4 個(gè)，對品種選育的自主創(chuàng)新要求進(jìn)一步提高。下面我將多年來在玉米品種真實(shí)性鑒定中的研究、應(yīng)用與思考進(jìn)行總結(jié)并和大家分享一下。
品種真實(shí)性概念解析
1）品種真實(shí)性鑒定真實(shí)性鑒定是對品種真實(shí)身份的鑒別，側(cè)重考察品種間是否存在明顯差異。真實(shí)性鑒定的過程是“找差異”的過程。從檢測目的看，可分為真實(shí)性驗(yàn)證和真實(shí)性身份鑒定兩大類。真實(shí)性驗(yàn)證屬于一對一的成對比較，一般指待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諛悠愤M(jìn)行比較，檢測該樣品的品種名稱是否名副其實(shí)。具體分以下幾種情況：
（1）與已審定品種標(biāo)準(zhǔn)樣品比較。主要目的是進(jìn)行市場打假，規(guī)范市場秩序，送樣單位一般為各省種子管理站、工商管理局等行政執(zhí)法部門。
（2）與來自農(nóng)業(yè)部品種權(quán)保護(hù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品比較。主要目的是鑒定是否發(fā)生侵權(quán)，送樣單位一般為司法機(jī)構(gòu)或品種權(quán)人。
（3）同一品種不同來源樣品之間比較。在區(qū)試中主要目的是監(jiān)控同一品種在不同參試年份或不同組別是否發(fā)生和更換；在品種權(quán)保護(hù)中主要目的是監(jiān)控由不同申請單位提供的同名的近似品種樣品是否相同；在育種中主要目的是監(jiān)控收集的不同來源同名自交系是否相同。
（4）與模仿對象進(jìn)行比較。育種單位采用模仿育種的方式進(jìn)行育種，需鑒定改良后的品種與原品種在DNA水平上是否發(fā)生了明顯變化，是否可以作為不同品種使用。
（5）姊妹系或近等基因系之間比較。育種單位采用連續(xù)回交、誘變、突變、轉(zhuǎn)基因等方式選育的自交系與其原始自交系之間，或采用二環(huán)系方式選育的連續(xù)自交6代后的不同姊妹系之間，遺傳相似度一般比較高，需要確定是否可以作為新自交系使用。
（6）跟蹤品種種性是否發(fā)生變化。主要目的是監(jiān)控品種在多年的繁育過程中，或者育種者持續(xù)提純復(fù)壯可能會帶來的種性上的改變。特別是一些推廣年限較長的品種，有可能與審定時(shí)相比已有明顯改變，應(yīng)作為不同品種重新進(jìn)行區(qū)試審定，而不能繼續(xù)推廣。
真實(shí)性身份鑒定屬于一對多的比較，一般是指待測樣品通過與已知品種標(biāo)準(zhǔn)指紋數(shù)據(jù)比對平臺篩查比較，確定該樣品的真實(shí)品種名稱。這種檢測需求的實(shí)現(xiàn)需要構(gòu)建比較完備的已知品種標(biāo)準(zhǔn)指紋數(shù)據(jù)庫，具體分以下幾種情況：
（1）在種子市場打假中，鑒定市場抽檢的品種仿冒了什么已知品種。
（2）在國家和各省區(qū)試中，鑒定區(qū)試品種是否與已知品種雷同，并作為品種能否推薦審定的必要條件。
（3）在品種權(quán)保護(hù)中，輔助篩查申請品種的最近似品種，代替原來由申請者自行提供。
2）玉米品種真實(shí)性鑒定與人類個(gè)體鑒定的比較品種鑒定與個(gè)體鑒定均是種以下的鑒定，二者主要區(qū)別如下：
（1）品種鑒定是對該品種的同質(zhì)群體的整體描述，而非對該品種的每一個(gè)個(gè)體的分別描述；個(gè)體鑒定是對每個(gè)單獨(dú)個(gè)體進(jìn)行鑒別，適用于群體內(nèi)部不同個(gè)體間差異大、區(qū)分個(gè)體有意義的情況，個(gè)體鑒定在植物上的需求較少，在人類及某些動物物種上需求較多。
（2）同一品種可多年多點(diǎn)組配或繁殖，對于自花授粉作物的品種或異花授粉作物的自交系，存在自交不充分或突變帶來的品種（系）內(nèi)剩余雜合位點(diǎn)問題，對于雜交品種，存在制種過程中隔離或去雄措施不力帶來的純度問題，造成不同年份、不同地點(diǎn)生產(chǎn)的種子之間可能出現(xiàn)若干微小差異；而個(gè)體鑒定時(shí)，同一個(gè)體在不同時(shí)期的取樣不存在變異。
（3）品種選育過程是育種家對材料進(jìn)行人工改造的過程，可創(chuàng)造出大量遺傳背景高度近似的品種，因此品種鑒定需要預(yù)先知道品種的變異范圍作為判定閾值；而個(gè)體鑒定所面對的個(gè)體是確定不變的，不同個(gè)體在DNA序列上應(yīng)存在可鑒別的差異。
（4）由于玉米雜交種是由獨(dú)立的兩個(gè)自交系雜交組配而成，而這兩個(gè)自交系均可獨(dú)立地與其它許多自交系組配，特別是優(yōu)良自交系，其使用頻率極高，造成大量品種是同父異母或同母異父，這對玉米品種鑒定提出了更高的要求。而人類具有一個(gè)或兩個(gè)共同親本的個(gè)體要少的多。
3）與真實(shí)性有關(guān)的詞語張冠李戴：包裝袋內(nèi)裝的種子與包裝袋上標(biāo)注的品種名稱不符。這種是一般意義上的真實(shí)性有問題的種子。
假而不劣：包裝袋內(nèi)裝的是優(yōu)良品種的種子，且純度、發(fā)芽率等質(zhì)量指標(biāo)符合要求，但包裝袋上標(biāo)注的是其它品種的名稱。這是一種特殊類型的真實(shí)性有問題的種子，一般是為了避開優(yōu)良品種的品種權(quán)，所以包裝袋上用自己的審定品種名稱，裝的是鄭單958等獲得品種權(quán)的優(yōu)良品種種子。
真假難辨：采用模仿育種的方式選育的品種，在 DNA 水平上遺傳差異較小，在表型上雖有微小差異，但需要特殊的調(diào)查方法或較長的時(shí)間（比如抗病性需要接種或特殊發(fā)病條件、品質(zhì)需要儀器檢測、軸色需要在生長后期才能調(diào)查等）。
這些品種如果通過審定進(jìn)入市場后，無論是被模仿的原始品種還是模仿產(chǎn)生的新品種，都會帶來維權(quán)難的問題。例如，大豐 30 與先玉 335，利用標(biāo)準(zhǔn)中的 40 個(gè)SSR引物檢測，只有 1 個(gè)位點(diǎn)差異，在表型上僅有軸色深淺的差異，很難有快捷高效的手段對市場上抽檢的這兩個(gè)品種的樣品準(zhǔn)確甄別出是哪個(gè)品種。
半真半假：待測樣品雖然標(biāo)簽上顯示是某品種，但在該品種中還摻混了一定比例的另一品種，這種混合種子就是一種半真半假的情況。在真實(shí)性檢測時(shí)，無論與標(biāo)簽顯示的品種還是與另一品種的標(biāo)準(zhǔn)樣品比較，都可能會判為無明顯差異，對真實(shí)性鑒定結(jié)果的出具造成干擾。
品種真實(shí)性鑒定與其它鑒定項(xiàng)目的比較
1）真實(shí)性鑒定與特異性鑒定、派生關(guān)系鑒定的比較真實(shí)性鑒定和特異性鑒定均是檢測不同品種（樣品）之間的關(guān)系，但二者還是有一定區(qū)別的：
（1）從概念和應(yīng)用范疇上講，真實(shí)性是指一批種子所屬品種、種或?qū)倥c文件描述或與備案的標(biāo)準(zhǔn)樣品是否相符，是種子檢測系統(tǒng)中使用的名詞；特異性是指申請品種權(quán)的植物新品種應(yīng)當(dāng)明顯區(qū)別于在遞交申請以前已知的植物品種，是品種權(quán)保護(hù)系統(tǒng)中使用的名詞；
（2）從檢測目的上講，真實(shí)性鑒定是檢測種子是否與標(biāo)示的品種名稱相符，是否具有真實(shí)性是判定種子質(zhì)量是否合格的指標(biāo)之一；特異性鑒定是檢測申請品種是否與所有已知品種都不同，是否具有特異性是判定是否成為新品種的必要條件；
（3）從所處階段及檢測對象上講，真實(shí)性鑒定一般在種子進(jìn)入銷售市場階段進(jìn)行，檢測對象是進(jìn)入生產(chǎn)和銷售環(huán)節(jié)的商品種子，特異性鑒定一般在區(qū)域試驗(yàn)階段和申請品種權(quán)保護(hù)階段進(jìn)行，檢測對象是尚未通過審定或獲得授權(quán)的試驗(yàn)用種；
（4）從檢測方案上講，真實(shí)性鑒定主要是待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較，如果不符則判定為真實(shí)性有問題，特異性鑒定是待測品種與所有已知品種比較，如果均不同則判定具有特異性。
當(dāng)然，兩者在檢測技術(shù)方法選擇上是具有共性的，在檢測實(shí)踐中兩種檢測需求也存在一定交叉，例如，在區(qū)域試驗(yàn)階段，一方面需要保證待測組合與所有已知品種不同，即具有特異性，一方面需要保證待測組合在不同年份、不同區(qū)組或不同省份參試時(shí)不會發(fā)生更換組合，即具有真實(shí)性。而且，由于國內(nèi)種子市場中仍存在個(gè)別品種在審定時(shí)不具有特異性就進(jìn)入生產(chǎn)銷售階段的情況，在種子質(zhì)量市場監(jiān)管階段，往往會出現(xiàn)真實(shí)性和特異性的問題并存的現(xiàn)象。
除了特異性，在 UPOV 公約 91 年文本中，還提出了實(shí)質(zhì)性派生品種（簡稱 EDV）的概念。我國近年來也在積極推進(jìn)實(shí)質(zhì)性派生品種制度的實(shí)施，比如農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 2018 年一號文件《關(guān)于大力實(shí)施鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略加快推進(jìn)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)型升級的意見》指出要“探索建立實(shí)質(zhì)性派生品種保護(hù)制度”；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種業(yè)管理司《2019 年推進(jìn)現(xiàn)代種業(yè)發(fā)展工作要點(diǎn)》提出“積極探索實(shí)施實(shí)質(zhì)性派生品種制度試點(diǎn)工作”。
品種派生關(guān)系鑒定（EDV鑒定）是對品種權(quán)保護(hù)中已判定具有特異性的品種，進(jìn)一步回答是獨(dú)立的品種還是與原始品種存在派生關(guān)系。與真實(shí)性鑒定相比，派生關(guān)系鑒定更側(cè)重考察品種間的遺傳背景的相似程度，因此所用指標(biāo)為遺傳相似度。派生關(guān)系鑒定的過程是“找相似”的過程。圖1展示了派生品種鑒定的思路：
圖1 獨(dú)立品種、派生品種、原始品種之間的關(guān)系
2）真實(shí)性鑒定與親子鑒定
品種真實(shí)性鑒定和親子鑒定均是檢測不同品種（樣品）之間的關(guān)系。對玉米而言，品種真實(shí)性鑒定是玉米雜交種間的比較或自交系品種間的比較，判定
是否相同。而親子鑒定是雜交種與自交系之間的溯源（見下圖），追溯組配雜交種的上一代親本自交系的鑒定，判定是否符合孟德爾遺傳。玉米品種的親子鑒定可以借鑒人類親子鑒定的算法和概念，將親子鑒定分為三聯(lián)體，二聯(lián)體和雙親皆疑三種情況：
（1）所謂三聯(lián)體，是指提供雜交種F1及雜交種的確定親本1、假設(shè)親本2，判定假設(shè)親本2是否是雜交種的真正親本。
（2）所謂二聯(lián)體，是指提供雜交種F1及雜交種的假設(shè)親本1，判定假設(shè)親本1是否是雜交種的真正親本。
（3）所謂雙親皆疑，是指提供雜交種F1及雜交種的假設(shè)親本1、假設(shè)親本2，判定親本組合“假設(shè)親本1×假設(shè)親本2”是否是雜交種的真正親本組合。
作物品種的親子鑒定的思路有四種：
（1）采用SSR、SNP等共顯性標(biāo)記，利用種子上的種皮、果皮等母本殘留組織（如玉米的果皮、水稻的稻殼、豆類的豆莢、瓜類的果殼等）直接獲得母本基因型，并結(jié)合雜交種基因型，依據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律，推測出父本基因型。該思路在雙親未知，僅有雜交種種子情況下就可以同時(shí)獲得雜交種及其雙親的基因型。
（2）利用胚乳等母本父本成分比例不同的組織，結(jié)合共顯性標(biāo)記，分解出雙親基因型。谷類作物胚乳中母本和父本成分所占比例為2:1，采用雜合子對稱擴(kuò)增的共顯性標(biāo)記進(jìn)行分型，母本和父本的兩個(gè)等位基因的擴(kuò)增產(chǎn)物量應(yīng)為2:1，因此占比為2的等位基因來自母本，占比為1的等位基因來自父本。該思路在雙親未知，僅有雜交種種子情況下就可以推測出雙親，適用于胚乳較大且容易剝離的種子，如玉米、小麥等單子葉植物的種子。
（3）根據(jù)雜交種的基因型，利三聯(lián)體或二聯(lián)體算法，從已知的自交系庫中篩查出可能的親本自交系，或利用雙親皆疑算法，從已知自交系庫中篩查可能的雙親組合。該思路適用范圍較廣，但需要有數(shù)據(jù)庫支持。
（4）利用葉綠體等母系遺傳成分，推測雜交種的可能母本自交系。該思路受限于葉綠體、線粒體等細(xì)胞質(zhì)成分的序列變異程度較低，只能作為親子鑒定的輔助手段。
3）真實(shí)性鑒定與純度鑒定
真實(shí)性和純度均是種子檢測系統(tǒng)中使用的名詞，檢測對象是進(jìn)入生產(chǎn)和銷售環(huán)節(jié)的商品種子，是判定種子質(zhì)量是否合格的指標(biāo)。
檢測實(shí)踐中，許多人真實(shí)性鑒定和純度鑒定混為一談：在制定真實(shí)性鑒定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，有人提出在真實(shí)性鑒定前必須先進(jìn)行純度鑒定，剔除不代表本品種的個(gè)體后，用標(biāo)準(zhǔn)個(gè)體進(jìn)行真實(shí)性鑒定；在制定純度鑒定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，有人提出在純度鑒定前必須先進(jìn)行真實(shí)性鑒定，只有真實(shí)性沒有問題的樣品才能進(jìn)行純度鑒定。實(shí)際上，如果純度鑒定的前提是樣品必須具有真實(shí)性，或者真實(shí)性鑒定的前提是樣品必須純度達(dá)標(biāo)，則大大增加了鑒定的復(fù)雜度，無法簡單快捷的開展純度鑒定。
檢測實(shí)踐中，應(yīng)將真實(shí)性鑒定和純度鑒定作為兩個(gè)獨(dú)立的鑒定項(xiàng)目，二者具有明顯的區(qū)別（具體區(qū)別詳見下表）：真實(shí)性鑒定涉及不同樣品之間的關(guān)系，檢測結(jié)果用不同、近似、相同等表示；而純度鑒定涉及同一樣品內(nèi)部不同個(gè)體之間的關(guān)系，檢測結(jié)果用本品種的種子數(shù)占供檢樣品種子數(shù)的百分率表示。
4）真實(shí)性鑒定與轉(zhuǎn)基因鑒定真實(shí)性
鑒定和轉(zhuǎn)基因成分鑒定是目前分子檢測機(jī)構(gòu)開展的兩類最常見的分子鑒定項(xiàng)目，兩類項(xiàng)目采用的技術(shù)手段相似，在實(shí)驗(yàn)室硬件條件和人員培訓(xùn)上的要求基本相同，因此許多實(shí)驗(yàn)室都在同時(shí)開展這兩項(xiàng)鑒定。然而二者的差異還是很明顯的：
（1）從鑒定標(biāo)記上看，真實(shí)性鑒定是對樣品整體遺傳背景的檢測，選用的 SSR 標(biāo)記具有物種特異性，玉米真實(shí)性鑒定的核心引物并不適用于其它物種，而轉(zhuǎn)基因鑒定是對目的基因的鑒定，檢測樣品中是否含有外源基因，選用的鑒定標(biāo)記只與所鑒定基因有關(guān)，具有物種通用性。
（2）從檢測方式看，真實(shí)性鑒定涉及樣品之間的關(guān)系，預(yù)先構(gòu)建可共享的已知品種標(biāo)準(zhǔn)DNA 指紋庫對開展真實(shí)性鑒定具有重要價(jià)值，而轉(zhuǎn)基因鑒定僅涉及待測樣品本身，不需要預(yù)先構(gòu)建 DNA 指紋庫。
（3）從試驗(yàn)污染控制上看，真實(shí)性鑒定的試驗(yàn)污染主要出現(xiàn)在樣品準(zhǔn)備階段，系同批次樣品的相互交叉污染，環(huán)境中的外源核酸一般不會對檢測產(chǎn)生影響，而轉(zhuǎn)基因鑒定的試驗(yàn)污染主要出現(xiàn)在 PCR 擴(kuò)增及電泳階段，環(huán)境中的外源核酸容易導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性，因此轉(zhuǎn)基因鑒定的試驗(yàn)污染控制更加嚴(yán)格。
隨著轉(zhuǎn)基因品種審定放開，針對轉(zhuǎn)基因品種的鑒定，不會僅局限于轉(zhuǎn)基因成分鑒定，至少會增加以下幾種新的檢測內(nèi)容：（1）檢測轉(zhuǎn)基因品種的遺傳背景與原品種是否相符，如果相符，作為原品種 EDV 品種，簡化區(qū)試試驗(yàn)程序；如果不相符，不作為原品種的EDV 品種，不能簡化區(qū)試試驗(yàn)程序。（2）檢測轉(zhuǎn)化體事件與申報(bào)的是否相符，即轉(zhuǎn)化體事件真實(shí)性。（3）檢測轉(zhuǎn)化體事件純度是否達(dá)標(biāo)。
5）真實(shí)性鑒定與自交系溯源
自交系（或純系）溯源是指追溯自交系（或純系）品種的可能祖先的鑒定。從實(shí)際鑒定需求看，分為兩種情況：一是鑒定育種家在新自交系或純系品種選育過程中使用了哪些已有的種質(zhì)資源作為選系親本，上溯的世代一般不超過十代；二是鑒定自交系的可能遠(yuǎn)古祖先，上溯的世代可達(dá)到上萬年。這類鑒定的思路有兩種：
（1）利用葉綠體、線粒體等細(xì)胞質(zhì)基因組差異實(shí)現(xiàn)母本祖先的追溯。葉綠體、線粒體等細(xì)胞質(zhì)成分系母系遺傳，不發(fā)生基因組的重組交換，且基因組序列保守性較強(qiáng)，能夠追溯到較遠(yuǎn)世代的母本祖先。這個(gè)方案的缺點(diǎn)是只能追溯到母本，無法追溯到父本。
（2）利用核基因組差異實(shí)現(xiàn)祖先的追溯。通過在核基因組上找到重組率低（或不重組）的區(qū)域，并在這些區(qū)域進(jìn)一步篩選突變率較高的區(qū)域，這些區(qū)域就能發(fā)揮類似葉綠體、線粒體基因組的溯祖作用，且可以追溯到雙親。
品種真實(shí)性鑒定的幾種可能方案
1）核心位點(diǎn)組合法（方案1）真實(shí)性鑒定的第一個(gè)方案是采用一套固定的核心位點(diǎn)組合鑒別不同品種。核心位點(diǎn)組合法自 2003 年首次提出來后，在作物品種的分子鑒定實(shí)踐中發(fā)揮了重要指導(dǎo)作用。已有幾十種作物相繼篩選了本作物的核心引物組合，并應(yīng)用于DNA 指紋庫構(gòu)建和品種真實(shí)性鑒定中。核心位點(diǎn)是優(yōu)先選用的具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、分布均勻等優(yōu)點(diǎn)的一套位點(diǎn)組合，綜合 UPOV 組織制定的《BMT 分子測試指南》和我國頒布的《植物品種鑒定 DNA 指紋方法總則》的相關(guān)內(nèi)容，核心位點(diǎn)選擇的指標(biāo)包括多態(tài)性高、數(shù)據(jù)容易統(tǒng)計(jì)、重復(fù)性好、不同平臺兼容性好、染色體分布情況清楚、在基因組上均勻分布、避免選擇零等位變異等。
不同作物核心位點(diǎn)組合的確定主要依據(jù)不同植物屬(種)的品種數(shù)量及品種間差異情況、染色體數(shù)目及基因組大小、位點(diǎn)多態(tài)性水平，兼顧不同標(biāo)記技術(shù)和不同檢測平臺的位點(diǎn)通量特點(diǎn)、檢測的速度和成本，并能夠區(qū)分該植物屬(種) 95% 以上的已知品種，核心位點(diǎn)組合的位點(diǎn)數(shù)量一般在幾十到幾百個(gè)之間。
圖 2 展示了核心位點(diǎn)組合法的原理：鑒定位點(diǎn)包括核心位點(diǎn)和擴(kuò)展位點(diǎn)兩大類，其中核心位點(diǎn)分為分組位點(diǎn)和品種區(qū)分位點(diǎn)兩級，位點(diǎn)數(shù)量分別在 1-10 個(gè)和 10-100 個(gè)的范圍，擴(kuò)展位點(diǎn)可分為若干級，隨著位點(diǎn)數(shù)量增加逐級擴(kuò)展（圖 2A）。面對大量品種，首先用核心位點(diǎn)中的分組位點(diǎn)將品種分為幾大組，然后用核心位點(diǎn)中的品種區(qū)分位點(diǎn)鑒別組內(nèi)不同品種，對于仍然無法區(qū)分的品種，繼續(xù)用擴(kuò)展核心位點(diǎn)進(jìn)行鑒別（圖2B）。
圖2 核心位點(diǎn)組合法的原理A：位點(diǎn)類型及各類位點(diǎn)的數(shù)量；B：品種DNA指紋鑒定的過程
2）特異分子標(biāo)簽法（方案2）品種真實(shí)性鑒定的另一個(gè)方案是為每一個(gè)品種找到一個(gè)獨(dú)特的序列標(biāo)簽（在電泳平臺上表現(xiàn)為譜帶或峰，在測序平臺上表現(xiàn)為一條 DNA 序列），該序列標(biāo)簽和品種之間建立一對一的關(guān)系。
早期提出的特征譜帶法，即針對固定的一套品種進(jìn)行大量的標(biāo)記篩選，為每個(gè)品種找到一個(gè)特異分子標(biāo)記，該方案僅在品種名單范圍固定的情況下有效，當(dāng)擴(kuò)大范圍后，原來具有特征譜帶的品種往往不再具有特征帶。
為了解決原有特征譜帶法的困境，進(jìn)一步提出了特異分子標(biāo)簽法，該方案的要點(diǎn)如下：
（1）分子標(biāo)簽必須是從外部導(dǎo)入的，且導(dǎo)入的標(biāo)簽必須是該物種基因組中不存在的序列。這就避免了特征譜帶法從本物種基因組內(nèi)部找的某一品種的特異標(biāo)簽理論上不能排除其它品種也會具有的問題。
（2）分子標(biāo)簽應(yīng)導(dǎo)入到重組率較低的染色體區(qū)域中，避免在雜交過程中因發(fā)生重組而容易丟失。
（3）分子標(biāo)簽可以是有意義的基因序列，也可以是不會造成表型改變的完全無意義序列，因此可以人工創(chuàng)造一條全新的特殊序列。
（4）分子標(biāo)簽可通過遠(yuǎn)緣種雜交、轉(zhuǎn)基因或基因編輯的手段導(dǎo)入到目標(biāo)品種上。分子標(biāo)簽在導(dǎo)入一個(gè)品種之前，是該物種以前的所有品種中沒有的，在導(dǎo)入一個(gè)品種上之后，只要有人使用該品種作為育種親本材料，就有可能將標(biāo)簽傳遞到新品種中去，因此標(biāo)簽不僅可以發(fā)揮鑒定的作用，還可以發(fā)揮跟蹤溯源的作用。圖 3 顯示了特異分子標(biāo)簽法的原理，該方法秉承了標(biāo)簽法的思想，在常規(guī)標(biāo)簽法和分子標(biāo)簽法的基礎(chǔ)上發(fā)展而來。常規(guī)標(biāo)簽法的標(biāo)簽與品種之間是松耦合的，標(biāo)簽容易發(fā)生脫落或交換，需要靠法律或規(guī)章約束才能保證標(biāo)簽與實(shí)物相符；分子標(biāo)簽法通過從品種的核基因組上尋找 DNA 標(biāo)簽，實(shí)現(xiàn)了標(biāo)簽與品種之間的緊耦合，但由于標(biāo)簽來自物種內(nèi)源的基因組序列，其特異性很難保障；特異分子標(biāo)簽法通過從外源導(dǎo)入非本物種的獨(dú)特的 DNA 標(biāo)簽，進(jìn)一步解決了標(biāo)簽的特異性問題。
隨著基因編輯等新技術(shù)的成熟應(yīng)用，將有望實(shí)現(xiàn)為每個(gè)品種添加本品種或本企業(yè)特有的標(biāo)簽序列。
3）兩種鑒定方案的比較
核心位點(diǎn)組合法和特異分子標(biāo)簽法是兩種不同的鑒定方案，各有優(yōu)勢，可根據(jù)不同的需求選擇合適的鑒定方案。核心位點(diǎn)組合法的優(yōu)勢：所有品種都通過一套固定核心位點(diǎn)組合進(jìn)行區(qū)分，不需要為每個(gè)品種確定一個(gè)特異的標(biāo)簽，適合大規(guī)模品種的統(tǒng)一鑒定和管理。而該方案的局限性：該方案能夠明確做出品種不同的判定，但不能做出品種相同的判定；鑒定一個(gè)品種所需的一套核心位點(diǎn)組合數(shù)量少則幾十到幾百，多則幾千到幾萬，試驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析的工作量較大；需要預(yù)先構(gòu)建基于核心位點(diǎn)組合的已知品種標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋庫，并結(jié)合表型和系譜信息，確定合適的判定閾值。
特異分子標(biāo)簽法的優(yōu)勢：每個(gè)品種只需要檢測其特異的標(biāo)簽，就可以確定是否為該品種，適合有重要價(jià)值的大品種的頻繁檢測，例如玉米上針對鄭單 958、京科 968 等大品種的維權(quán)打假。而該方案的局限性：采用某品種的特異標(biāo)簽鑒定時(shí)，如果鑒定結(jié)果表明不是該品種，不能進(jìn)一步確定是什么品種，因此不適合對大量未知品種的檢測；特異標(biāo)簽需要預(yù)先導(dǎo)入，目前的導(dǎo)入技術(shù)難度和成本還比較高；標(biāo)簽要想發(fā)揮鑒定和溯源作用，需要建立嚴(yán)格的保密管理，標(biāo)簽管理一旦失控，就會失去和品種的一一對應(yīng)關(guān)系；品種在導(dǎo)入標(biāo)簽前需要預(yù)先證明其具有特異性，否則即使導(dǎo)入了標(biāo)簽也不能作為具有特異性的品種對待。
品種真實(shí)性鑒定技術(shù)的選擇
1）表型鑒定與分子鑒定的比較與分子鑒定通過選取一套核心位點(diǎn)組合的方案相似，在植物品種權(quán)保護(hù)上也建立了一套基于形態(tài)性狀的品種鑒定體系-DUS 測試，通過選擇一套適合的形態(tài)性狀進(jìn)行表型數(shù)據(jù)采集，采用數(shù)據(jù)庫比較或成對并排種植比較鑒定品種間的差異。由于兩種鑒定體系的目標(biāo)都是進(jìn)行品種鑒別，必然面臨著表型鑒定和分子鑒定的結(jié)果如何結(jié)合的問題。在植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（簡稱 UPOV ）的框架下，提出了三種可能的結(jié)合方式：一是利用與形態(tài)性狀連鎖或基因內(nèi)的分子標(biāo)記，即功能標(biāo)記進(jìn)行形態(tài)性狀的預(yù)測，這種方式難度較大，僅在某些抗病性狀、雄性不育性狀上進(jìn)行了少量研究，但仍不能做到完全一一對應(yīng)。二是建立形態(tài)性狀差異和分子標(biāo)記性狀差異之間的相關(guān)性關(guān)系，這種方式是目前的研究重點(diǎn)，已經(jīng)在玉米、大麥等作物上進(jìn)行了有益的探索，初步結(jié)果表明二者具有一定的相關(guān)性，但并非線性相關(guān)關(guān)系，基于已有研究結(jié)果，建立形態(tài)性狀和分子標(biāo)記結(jié)合使用的應(yīng)用模型。三是將 DNA 指紋作為一套不同于形態(tài)性狀的獨(dú)立鑒定系統(tǒng)，建立自己的鑒定規(guī)則，這種方式在人類身份鑒定上得到采用，在植物品種鑒定上雖未達(dá)成一致的意見，但進(jìn)行了有益的嘗試，在玉米上分別建立了 SSR 和 SNP 的分子鑒定體系，并表明這兩套分子鑒定體系之間具有高度的相關(guān)性。
值得思考的問題是：為什么在人類 DNA 指紋身份鑒定中不僅不需要分子標(biāo)記和表型之間有關(guān)聯(lián)，還要求盡量避免分子標(biāo)記與表型之間存在關(guān)聯(lián)，以防止 DNA 指紋采集會帶來個(gè)人隱私的泄露；與表型關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記并不是用于身份鑒定需求，而是用于疾病篩查等特殊目的。因此，從品種鑒定的角度看，是否需要建立表型與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)仍是一個(gè)值得商榷的問題。
2）不同分子標(biāo)記的類型及特點(diǎn)
（1）按所在基因組類型分類基因組類型主要分為細(xì)胞核基因組和細(xì)胞質(zhì)（葉綠體，線粒體等）基因組。位于這兩類基因組上的分子標(biāo)記，具有不同的遺傳規(guī)律。a)位于細(xì)胞核基因組：孟德爾遺傳。變異主要來源于重組和突變。b)位于細(xì)胞質(zhì)基因組：母性遺傳。變異主要來源于突變。
（2）按是否位于染色體特定位置分類在分子標(biāo)記發(fā)展的早期，由于沒有豐富的基因組測序信息，設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記一般是隨機(jī)標(biāo)記，檢測基因組的位置是不確定的，或未知的。而隨著基因組測序技術(shù)的成熟及大量物種的基因組測序，就可以針對基因組特定位置上的變異設(shè)計(jì)標(biāo)記，檢測位置是固定的。a)隨機(jī)標(biāo)記：代表性標(biāo)記包括RAPD、AFLP、ISSR。優(yōu)點(diǎn)：跨物種通用引物，多位點(diǎn)同時(shí)檢測。缺點(diǎn)：間接反映基因組的變異類型，不利于數(shù)據(jù)整合及建庫。b)特異標(biāo)記：代表性標(biāo)記包括SSR、SNP、INDEL。優(yōu)點(diǎn)：有利于數(shù)據(jù)整合及建庫，直接反映基因組的變異類型。缺點(diǎn)：一般不能跨物種使用。
（3）按染色體的變異類型分類染色體的變異類型很多，小的序列變異由于容易開發(fā)分子標(biāo)記，在品種鑒定中得到廣泛應(yīng)用。而大的序列變異，雖然更容易造成基因型和表型的明顯變化，但一是數(shù)量較少，二是不容易開發(fā)合適的分子標(biāo)記，尚未在品種鑒定中廣泛應(yīng)用。a)小的序列變異：包括SSR（簡單重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)變異）、SNP（單個(gè)核苷酸變異）、INDEL（小的序列插入或缺失變異）。
大的序列變異：包括基因組上大片段的插入、缺失、重復(fù)、倒位、易位等。
（4）按單一變異還是復(fù)合變異分類對所開發(fā)的分子標(biāo)記而言，目標(biāo)檢測區(qū)域內(nèi)可能包括1個(gè)變異，也可能包括多個(gè)變異，可能只有1種變異，也可能有多種變異。檢測區(qū)域如果只有一個(gè)變異，檢測方法一般比較簡單，是目前最主要的分子標(biāo)記類型。檢測區(qū)域有多個(gè)或多種變異的，以往由于沒有合適的檢測平臺，在分子標(biāo)記開發(fā)中，往往會預(yù)先將這類變異過濾淘汰。隨著測序技術(shù)的不斷成熟和廣泛推廣應(yīng)用，復(fù)合變異類型也有了檢測平臺，因此未來這類變異也可以使用。a)單一變異：檢測區(qū)域內(nèi)只有一個(gè)變異，如SSR、SNP、INDEL等。b)復(fù)合變異：檢測區(qū)域內(nèi)存在多個(gè)變異或多種變異。優(yōu)點(diǎn)：單個(gè)檢測區(qū)域的多態(tài)性增加。缺點(diǎn)：增加基因型統(tǒng)計(jì)的復(fù)雜性，且只能采用測序平臺檢測。
（5）按等位變異數(shù)是兩個(gè)還是多個(gè)分類對于一個(gè)變異位點(diǎn)，其等位變異數(shù)有多少個(gè)，是該變異位點(diǎn)的重要特征之一。然而，等位變異數(shù)多少是一個(gè)雙刃劍：等位變異數(shù)少，區(qū)分能力弱，但數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和整合更容易；等位變異數(shù)多，一般該位點(diǎn)的區(qū)分能力強(qiáng)，但數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)整合難度增加。a)等位變異數(shù)只有兩種：分子標(biāo)記表現(xiàn)為二態(tài)型，如SNP、INDEL。優(yōu)點(diǎn)：有專門針對二態(tài)型標(biāo)記的樣品高通量的KASP平臺和位點(diǎn)高通量的芯片平臺。缺點(diǎn)：多態(tài)性較低，雜合基因型只有1種。b)等位變異數(shù)超過兩種：分子標(biāo)記表現(xiàn)為復(fù)等位基因。如SSR等。
（6）按物種特用還是物種通用分類物種數(shù)量非常龐大，是針對每個(gè)物種開發(fā)僅適合該物種的分子標(biāo)記，還是為所有物種提供一套物種通用型分子標(biāo)記或檢測方案，這是一個(gè)問題。早期階段，由于沒有豐富的基因組測序信息，因此發(fā)展了RAPD、AFLP等適合大多數(shù)物種的隨機(jī)標(biāo)記；隨著一批重要物種的基因組組測序數(shù)據(jù)的積累，這些物種就有可能開發(fā)物種特用的分子標(biāo)記；然而，開發(fā)物種特用分子標(biāo)記投入較大，對大量小物種而言，仍然需要提供物種通用型的檢測方案。a)物種特用：根據(jù)特定物種的基因組序列變異情況，開發(fā)的適合該物種基因分型的標(biāo)記。目前開發(fā)的SSR、SNP、INDEL標(biāo)記主要是針對特定物種開發(fā)的。b)物種通用：有三種途徑，一是隨機(jī)標(biāo)記，如RAPD、AFLP、ISSR；二是利用物種間的共線性，開發(fā)在不同物種都能檢測到特定位置變異的物種通用標(biāo)記：三是直接測序，如簡化測序、低深度重測序等。
（7）按是否與表型相關(guān)分類中性學(xué)說認(rèn)為分子水平上的大多數(shù)突變是中性或近中性的，自然選擇對它們不起作用，這些突變?nèi)恳淮忠淮碾S機(jī)漂變而被保存或趨于消失，從而形成分子水平上的進(jìn)化性變化或種內(nèi)變異。目前開發(fā)的分子標(biāo)記主要是這類中性標(biāo)記，由于受選擇壓力的影響較小，群體的等位基因頻率分布均勻，因此其品種識別能力較強(qiáng)。與表型變異相關(guān)的功能標(biāo)記開發(fā)的比較少，主要應(yīng)用在分子輔助育種中，在品種鑒定中應(yīng)用較少。a)中性標(biāo)記：在基因組上隨機(jī)選取的，與表型性狀沒有明顯相關(guān)的標(biāo)記。b)功能標(biāo)記：根據(jù)功能基因內(nèi)部引起表型性狀變異的多態(tài)性基序開發(fā)的標(biāo)記。
品種真實(shí)性分子鑒定標(biāo)準(zhǔn)的研制
大規(guī)模開展品種真實(shí)性鑒定需要成熟的分子鑒定標(biāo)準(zhǔn)，既包括為每個(gè)作物制定的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，也包括指導(dǎo)所有作物標(biāo)準(zhǔn)研制的指南或總則。
1）國際 BMT 分子測試指南與我國植物品種鑒定 DNA 指紋方法總則 BMT 分子測試指南是國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）為建立一套統(tǒng)一的試驗(yàn)方法，以期在分子檢測過程中獲取高質(zhì)量的分子數(shù)據(jù)，同時(shí)滿足不同實(shí)驗(yàn)室利用不同技術(shù)方法構(gòu)建植物品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫的需要而制定的分子測試指南，該指南對分子標(biāo)記的選擇、分析材料的來源類型及樣品量、分析方法的標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行了原則上的規(guī)范，對利用分子檢測技術(shù)開展品種測試及DNA指紋庫構(gòu)建具有重要的指導(dǎo)意義。
我國于1999年4月23日正式加入《國際植物新品種保護(hù)公約》1978年文本，成為UPOV第39個(gè)成員國，我單位自2005年開始參加BMT歷屆會議，跟蹤國際上DNA指紋技術(shù)在各類植物品種鑒定上的最新應(yīng)用進(jìn)展，并參與BMT分子測試指南修訂。
參考BMT分子測試指南，同時(shí)結(jié)合我國目前品種鑒定技術(shù)發(fā)展水平，2014制定適用于我國的植物品種鑒定的DNA指紋方法總則，并于2016年進(jìn)行了修訂。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《植物品種鑒定DNA分子標(biāo)記法總則》（NY/T2594-2016）從DNA分子標(biāo)記類型的基本條件、核心和擴(kuò)展的選擇原則、樣品制備、檢測程序、數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的基本要求、指紋數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)規(guī)則等方面對DNA指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建進(jìn)行了全面的規(guī)范，對加快各個(gè)作物分子鑒定標(biāo)準(zhǔn)研制發(fā)揮了重要的指導(dǎo)作用。
在此基礎(chǔ)上，我國已經(jīng)頒布了糧食作物普通小麥、高粱、大豆、小麥；纖維作物陸地棉、棉花；蔬菜作物大白菜、黃瓜、結(jié)球甘藍(lán)、番茄、辣椒、甘藍(lán)型油菜；瓜果類作物蘋果、西瓜；花卉作物百合等多種作物分子鑒定標(biāo)準(zhǔn)。
2）玉米品種真實(shí)性分子鑒定系列標(biāo)準(zhǔn)玉米品種真實(shí)性鑒定標(biāo)準(zhǔn)研制中的關(guān)鍵指標(biāo)主要包括以下幾個(gè)方面：
（1）樣品取樣方式和取樣量的確定。選擇最佳的取樣方式和最優(yōu)的樣本數(shù)量在真實(shí)性鑒定中具有重要意義，不僅關(guān)系到檢測結(jié)果是否準(zhǔn)確，還關(guān)系到工作量和檢測成本等實(shí)際問題。玉米品種根據(jù)種子繁殖方式及樣品預(yù)期一致性情況，可選擇混合取樣或個(gè)體取樣進(jìn)行檢測。
（2）核心位點(diǎn)的篩選確定?；诙嗥脚_、多實(shí)驗(yàn)室的廣泛測試，代表性樣品的多態(tài)性評估、引物組合區(qū)分效率、均勻分布、擴(kuò)增片段大小等原則確定核心位點(diǎn)。經(jīng)過上述篩選程序，玉米分別篩選確定96個(gè)SNP位點(diǎn)、40個(gè)SSR位點(diǎn)作為真實(shí)性鑒定的核心位點(diǎn)。
（3）檢測平臺的選擇。在選擇適合的核心位點(diǎn)檢測時(shí)，應(yīng)選用配套的檢測平臺和多重實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系，保證真實(shí)性鑒定中的結(jié)果具有可重復(fù)性和穩(wěn)定性。SSR優(yōu)先推薦選用熒光毛細(xì)管電泳檢測平臺，SNP優(yōu)先推薦KASP熒光檢測平臺。
（4）指紋數(shù)據(jù)的采集記錄。SSR指紋數(shù)據(jù)采用等位變異大小統(tǒng)計(jì)法，即記錄待測品種在每個(gè)引物位點(diǎn)上的電泳譜帶片段大小作為等位變異的命名；SNP指紋數(shù)據(jù)采用等位變異統(tǒng)計(jì)法，即統(tǒng)計(jì)SNP的AGCT作為等位變異的命名。
（5）參照樣品的篩選和使用。使用參照品種的目的是輔助確定待測樣品的等位變異以及校正儀器設(shè)備的系統(tǒng)誤差。參照樣品篩選時(shí)，為了提高參照樣品使用時(shí)的便利性，一方面需要考慮參照樣品的代表性和易獲取性，一方面需要考慮如何用最少的參照樣品代表鑒定位點(diǎn)的最多的等位變異。
（6）結(jié)果判定。在使用較少的核心位點(diǎn)時(shí)，差異位點(diǎn)數(shù)作為判定樣品異同的衡量指標(biāo)。按照統(tǒng)一技術(shù)路線，選取代表性材料，在位點(diǎn)挖掘、實(shí)驗(yàn)效果評價(jià)、多態(tài)性分析、確定區(qū)分效率、多實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證等方面進(jìn)行充分評估，確定玉米品種真實(shí)性鑒定位點(diǎn)組合及其配套標(biāo)準(zhǔn)化檢測體系，制訂了玉米分子檢測系列標(biāo)準(zhǔn)，部分標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)過了多次修訂，包括：
國家標(biāo)準(zhǔn)《主要農(nóng)作物品種真實(shí)性和純度SSR分子檢測玉米》（GB/T39914-2021）；部頒標(biāo)準(zhǔn)《玉米品種鑒定DNA指紋方法》（NY/T1432-2007）；部頒標(biāo)準(zhǔn)《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法》（NY/T1432-2014）；部頒標(biāo)準(zhǔn)《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SNP分子標(biāo)記法》（NY/T4022-2021）；《玉米品種鑒定DNA指紋方法》（NY/T1432-2007）和《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法》（NY/T1432-2014）已成為在司法鑒定中應(yīng)用案例最多的農(nóng)作物品種鑒定標(biāo)準(zhǔn)，在政府種子質(zhì)量監(jiān)督抽查、區(qū)域試驗(yàn)、品種權(quán)保護(hù)中發(fā)揮重要的技術(shù)支撐作用。
《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SNP分子標(biāo)記法》（NY/T4022-2021）中，與SSR檢測標(biāo)準(zhǔn)相比，除了提供96個(gè)SNP位點(diǎn)用于真實(shí)性驗(yàn)證外，還進(jìn)一步提供了61214個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行品種真實(shí)性身份鑒定。
對玉米品種真實(shí)性身份鑒定判定的閾值設(shè)定綜合考慮玉米品種變異、現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)或指南以及檢測系統(tǒng)誤差等各種因素，將判定閾值設(shè)為位點(diǎn)相似度92%-97%，即位點(diǎn)相似度≤92%的排除為同一品種，位點(diǎn)相似度≥97%疑似為同一品種，介于兩者之間的為不確定區(qū)間，需提供其他輔助材料進(jìn)行判定。該標(biāo)準(zhǔn)將于2022年6月1日正式實(shí)施，將對近似品種或派生品種的鑒定提供更加精準(zhǔn)高效的技術(shù)手段。
3）真實(shí)性鑒定標(biāo)準(zhǔn)的推廣應(yīng)用玉米真實(shí)性鑒定系列分子標(biāo)準(zhǔn)在我國已得到快速推廣和應(yīng)用，為種子市場的繁榮和穩(wěn)定提供了有力的技術(shù)支撐：
（1）種子質(zhì)量監(jiān)督管理上，2010年起，玉米真實(shí)性納入到農(nóng)業(yè)部種子質(zhì)量管理中，在春季種子市場監(jiān)督抽查中首次包括了真實(shí)性檢測項(xiàng)目；2011年起，在擴(kuò)大春季種子市場監(jiān)督抽查規(guī)模的基礎(chǔ)上，增加了冬季種子企業(yè)督查行動；2012年起，增加了制種基地夏季巡查；2013年起，增加了典型縣市的種子市場摸底行動。至此，我國玉米種子真實(shí)性管理實(shí)現(xiàn)了從制種基地源頭到企業(yè)加工中間環(huán)節(jié)到種子銷售市場終端的全程監(jiān)控體系。
（2）區(qū)域試驗(yàn)管理上，2002年起，啟動國家區(qū)試京津唐、黃淮海、西南和武陵山區(qū)四個(gè)組的玉米品種真實(shí)性檢測，由北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心和四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所承擔(dān)檢測任務(wù)；2003-2004年將國家區(qū)試檢測范圍逐步擴(kuò)大到所有8個(gè)普通玉米組，并由區(qū)試擴(kuò)展到預(yù)試；2005年起制定并試行DNA指紋檢測標(biāo)準(zhǔn)及管理辦法，北京市農(nóng)林科學(xué)院負(fù)責(zé)國家區(qū)試所有參試玉米品種標(biāo)準(zhǔn)樣品入庫長期保存，區(qū)試檢測范圍從國家區(qū)試逐步擴(kuò)大到省區(qū)試，遼寧省率先啟動區(qū)試玉米品種檢測工作；2006年起，將國家區(qū)試檢測范圍擴(kuò)大到青貯、甜糯、爆裂等特用玉米組，實(shí)現(xiàn)對國家區(qū)試組合檢測的全覆蓋；2007年起，逐步擴(kuò)大省區(qū)試檢測范圍，至2014年已將玉米區(qū)試檢測范圍覆蓋全國20多個(gè)玉米省份；2016年起，啟動國家聯(lián)合體、企業(yè)綠色通道試驗(yàn)，并將其納入真實(shí)性檢測范圍。
（3）品種權(quán)測試上，2004年起，開始探索分子技術(shù)在DUS測試中的應(yīng)用；2010年起，構(gòu)建品種權(quán)保護(hù)品種DNA指紋庫，并輔助篩查近似品種；2016年起，探索派生品種鑒定的技術(shù)研究及標(biāo)準(zhǔn)化。
（4）社會需求上，隨著玉米真實(shí)性檢測標(biāo)準(zhǔn)的頒布實(shí)施，來自企業(yè)維權(quán)、工商打假、司法鑒定、科研育種、農(nóng)民維權(quán)等方面的檢測需求呈逐年上升趨勢。
總結(jié)及未來展望
1）技術(shù)選擇：新舊之爭對真實(shí)性分子檢測技術(shù)的研發(fā)歷程，伴隨著對新舊技術(shù)的爭議，特別是SSR和SNP兩種標(biāo)記技術(shù)，最終是替代關(guān)系，還是長期并存關(guān)系？在2010年左右的時(shí)候，就有人認(rèn)為SSR已經(jīng)過時(shí)了，SNP必將替代SSR。然而，十年后的今天，我們已經(jīng)看到了答案，這兩個(gè)技術(shù)是優(yōu)勢互補(bǔ)的：SSR技術(shù)具有多態(tài)性高，區(qū)分能力強(qiáng)的優(yōu)勢，可以用較少的位點(diǎn)區(qū)分大部分品種，適合電泳檢測平臺，從而有利于技術(shù)的推廣普及；但數(shù)據(jù)整合共享有一定難度，且不易實(shí)現(xiàn)大量位點(diǎn)的高通量檢測。
而 SNP 技術(shù)有效彌補(bǔ)了 SSR 的不足，具有檢測通量高的優(yōu)勢，可實(shí)現(xiàn)上萬個(gè)位點(diǎn)或上萬個(gè)樣品的快速檢測，且數(shù)據(jù)分型簡單，數(shù)據(jù)容易實(shí)現(xiàn)整合共享；但喪失了 SSR 的優(yōu)點(diǎn)，單個(gè)標(biāo)記多態(tài)性低，區(qū)分能力弱，檢測平臺昂貴，限制了技術(shù)的大規(guī)模推廣普及。
在實(shí)際需求中，SSR 更適合品種真實(shí)性鑒定，特別是能夠解決雜交種鑒定的問題；而SNP 更適合在自交系或育種群體中應(yīng)用，特別是派生品種（EDV）鑒定、輔助育種中的前景和背景選擇等。雖然就個(gè)別單位而言，因業(yè)務(wù)側(cè)重點(diǎn)不同，可能會以其中一種技術(shù)為主體，但從全國總體而言，這兩種技術(shù)未來將會長期共存。
從更廣泛的意義講，技術(shù)沒有新舊之分，只有是否有用之分。各種技術(shù)不斷的被提出，經(jīng)過大浪淘沙，大量的技術(shù)被淘汰，不留一絲痕跡，較少或從未被使用；少量的技術(shù)在一定時(shí)期、一定范圍內(nèi)得到使用，發(fā)揮了階段性作用；極少數(shù)的技術(shù)被沉淀下來，在較長時(shí)期、較大范圍內(nèi)發(fā)揮作用，成為經(jīng)典技術(shù)?？梢源_定，SSR和SNP技術(shù)是作為經(jīng)典技術(shù)被保留下來的，還有巨大的使用空間。
2）服務(wù)對象：一視同仁在玉米上，真實(shí)性分子鑒定技術(shù)已在區(qū)試、品種權(quán)保護(hù)、市場監(jiān)督抽查、企業(yè)維權(quán)等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。然而，偶爾會聽到一些聲音，認(rèn)為真實(shí)性鑒定技術(shù)主要保護(hù)了國外公司的育種，存在為誰打假，為誰維權(quán)，為誰服務(wù)的疑問。為鄭單 958 維權(quán)，沒意見，為先玉 335 維權(quán)，怎么看？
從檢測實(shí)踐看，無論對國內(nèi)公司，還是國外公司，必須要一視同仁。正是在玉米上有了成熟的真實(shí)性鑒定技術(shù)，才讓玉米產(chǎn)業(yè)得到良性發(fā)展，只有采用相同的規(guī)則，我們才能正視自己的不足，只有擁有與狼共舞的勇氣與實(shí)力，我們才能快速成長進(jìn)步。
其實(shí)，正是采用相同的游戲規(guī)則，這 20 年來，國內(nèi)玉米育種水平得到大幅提升，充分消化利用國內(nèi)外育種資源后的自主研發(fā)品種成為主流，國內(nèi)自育品種的維權(quán)需求也非常迫切。所以，真實(shí)性鑒定技術(shù)的保駕護(hù)航，不僅沒有阻礙國內(nèi)育種研發(fā)，相反是助力了玉米的國內(nèi)自主育種。
3）終極局面：天下無賊為什么要開展真實(shí)性鑒定技術(shù)研究？初衷顯然是希望為品種及種子管理提供強(qiáng)大的技術(shù)手段，讓政府管理更加高效，讓農(nóng)民用種更加安全，讓企業(yè)品種創(chuàng)新更有動力，最終實(shí)現(xiàn)“天下無賊”的理想局面。當(dāng)那一天到來的時(shí)候，真實(shí)性鑒定可能真的不需要了。
技術(shù)的研發(fā)者希不希望同時(shí)作為技術(shù)的終結(jié)者？是否會忘了初衷，希望市場越來越亂，從而讓自己的存在感越來越強(qiáng)？至少對真實(shí)性分子鑒定技術(shù)而言，這個(gè)顧慮是可以避免的：
首先，對真實(shí)性鑒定的需求是不斷深化的，從而需要技術(shù)不斷的更新提升，常做常新，比如，隨著轉(zhuǎn)基因的放開，轉(zhuǎn)基因品種具有不同于常規(guī)品種的特點(diǎn)，相應(yīng)的真實(shí)性鑒定技術(shù)也要調(diào)整和改進(jìn)；隨著對品種創(chuàng)新要求提高，派生品種的鑒定需求也會逐步增多；隨著申請品種權(quán)保護(hù)的自交系數(shù)量的增多，自交系維權(quán)具有不同于雜交種的特點(diǎn)，可能需要提供親子鑒定等輔助手段；隨著更多的作物類型納入品種管理，物種專用型的真實(shí)性鑒定方案不利于檢測機(jī)構(gòu)高效開展檢測，可能需要提供適用于多物種的通用型鑒定方案。
其次，基于真實(shí)性鑒定需求研發(fā)的分子技術(shù)平臺同樣適用于種質(zhì)資源研究、分子輔助育種等需求，即使管理品種的需求減少，創(chuàng)制優(yōu)異新種質(zhì)、選育優(yōu)良新品種的需求并不會減少，且品種管理形成的分子大數(shù)據(jù)對育種還具有重要的參考價(jià)值。讓我們期待那一天的到來。
