編者按
雜種優(yōu)勢利用是提高作物產(chǎn)量的有效途徑。雜交種往往比雙親具有更高的產(chǎn)量和更好的抗性。作物雜交種培育依賴于雄性不育系與父本的雜交來生產(chǎn)子代雜交種。因此，作物雄性不育系的培育和維持是雜種優(yōu)勢利用的重要前提。目前生產(chǎn)上使用的作物雄性不育系主要分為穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)不育系和不穩(wěn)定的細(xì)胞核不育系兩類，不僅其創(chuàng)制過程極為復(fù)雜，在生產(chǎn)上也存在很多限制。2020年7月8日，Molecular Plant 在線發(fā)表了中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院謝傳曉和李新海研究員領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)題為“Genome Editing Enables Next-Generation Hybrid Seed Production Technology“的研究論文，報(bào)道了基于基因編輯技術(shù)發(fā)展了新一代作物不育系和雜交種培育的簡易方法。鑒于該研究具有重要的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值，我們有幸邀請到中科院遺傳所高彩霞研究員與華南農(nóng)業(yè)大學(xué)王海洋教授對該論文研究工作分別做了點(diǎn)評與詳細(xì)解讀，以饗讀者！
https://doi.org/10.1016/j.molp.2020.06.003
專家點(diǎn)評
基因編輯技術(shù)助推第三代作物雜交育種技術(shù)發(fā)展
高彩霞（中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所）
雜交種是作物雜種優(yōu)勢利用應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的品種類型。雜交種生產(chǎn)上需要雙親（或多親）雜交，避免親本自交成為種子生產(chǎn)環(huán)節(jié)必須解決的核心問題，雄性不育系應(yīng)用是解決該問題的重要途徑。因此，作物雄性不育是作物雜種優(yōu)勢利用的關(guān)鍵技術(shù)，具有重要的意義與價(jià)值。
現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展史上作物雄性不育技術(shù)的每一次進(jìn)步都對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)做出了巨大貢獻(xiàn)。以水稻為例，基于細(xì)胞質(zhì)雄性不育系發(fā)展而來的第一代“三系法”雜交稻和基于光溫敏感雄性核不育系發(fā)展而來的“兩系法”雜交稻均獲得了大面積應(yīng)用。為克服傳統(tǒng)“三系法”恢、保關(guān)系的限制和“兩系法”受光溫等不可控環(huán)境因子的影響，隨著分子生物學(xué)與現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，培育基于隱性核不育基因的第三代作物雜交育種技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。然而，已有的第三代雜交種技術(shù)需將隱性核不育突變位點(diǎn)回交導(dǎo)入到不同背景中創(chuàng)制不育系，并需在此基礎(chǔ)之上為不育系提供生物技術(shù)元件，以實(shí)現(xiàn)不育系與保持系的繁殖和分揀。整個(gè)過程耗時(shí)長，步驟復(fù)雜。當(dāng)前日新月異發(fā)展的新興生物技術(shù)，如基因編輯技術(shù)為解決這一問題提供了新的技術(shù)途徑
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究人員利用基因編輯實(shí)現(xiàn)了一步法創(chuàng)制雄性核不育系并篩選得到配套的保持系，該研究利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯定點(diǎn)刪除了玉米內(nèi)源MS26基因重要功能域，創(chuàng)制了ms26ΔE5隱性不育系，該編輯活性不影響同時(shí)提供的保持系所需的MS26基因的互補(bǔ)表達(dá)盒，并實(shí)現(xiàn)了保持系生物技術(shù)元件半合子遺傳及其與不育系種子的熒光分揀。該技術(shù)可以拓展應(yīng)用于其他雜交種作物中具有產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價(jià)值的細(xì)胞核育性基因種子產(chǎn)業(yè)化，為第三代作物雜交種技術(shù)提供了高效的解決方案，將助推第三代作物雜交育種技術(shù)的發(fā)展和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。該研究是利用基因編輯技術(shù)為農(nóng)作物育種領(lǐng)域傳統(tǒng)途徑無法克服問題提供有效解決方案的又一個(gè)案例。
論文解讀
王海洋（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)）
雄性不育是作物雜種優(yōu)勢利用的關(guān)鍵，根據(jù)育性基因的來源分為細(xì)胞質(zhì)雄性不育 (CMS)以及細(xì)胞核雄性不育(GMS)兩類[1]。上個(gè)世紀(jì)70年代，基于CMS發(fā)展而來的第一代雜交水稻育種技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了不育系、保持系與恢復(fù)系“三系”配套，并在生產(chǎn)上得到了大規(guī)模應(yīng)用。但是第一代雜交水稻育種技術(shù)受制于嚴(yán)格的恢、保關(guān)系的制約，不僅培育過程復(fù)雜，而且資源利用效率低下。
上個(gè)世紀(jì)90年代，水稻育種家們成功開發(fā)出了利用光、溫敏感的細(xì)胞核雄性不育系(GMS)和父本雜交生產(chǎn)雜交種的“兩系法，被稱為第二代雜交水稻育種技術(shù)。“兩系法”克服了第一代CMS技術(shù)對恢復(fù)系的限制，也取得了大規(guī)模應(yīng)用。但是“兩系法”因受到光溫等不可控環(huán)境因子的影響，生產(chǎn)上存在一定的風(fēng)險(xiǎn)[2]。
近年來隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，科學(xué)家們提出了利用隱性核不育基因創(chuàng)制穩(wěn)定的核不育系的設(shè)想，即通過把兩個(gè)連鎖的育性恢復(fù)基因和花粉失活基因通過轉(zhuǎn)基因手段轉(zhuǎn)入到一個(gè)隱性雄性不育背景中，從而創(chuàng)制一個(gè)轉(zhuǎn)基因雄性保持系。轉(zhuǎn)基因雄性保持系自交后可以產(chǎn)生一半轉(zhuǎn)基因雄性保持系種子和一半不含轉(zhuǎn)基因的不育系種子 [3]。在此基礎(chǔ)上，后人進(jìn)一步提出了利用一個(gè)種子熒光標(biāo)記基因可以實(shí)現(xiàn)不育系和轉(zhuǎn)基因保持系的分選 [4]。2006年美國杜邦公司率先在玉米上成功開發(fā)了該技術(shù)，稱之為種子生產(chǎn)技術(shù) （Seed Production Technology, SPT）[5]，隨后我國科學(xué)家們很快在水稻和玉米上開發(fā)出了類似的技術(shù)系統(tǒng) [6,7,8]。這些技術(shù)都需要篩選合適的自然GMS不育系，并將其突變基因通過多代回交導(dǎo)入到其他雜交種生產(chǎn)的母本背景中，并在此基礎(chǔ)上再通過轉(zhuǎn)基因手段把導(dǎo)入保持系需要的多個(gè)生物技術(shù)元件，步驟多而繁瑣，進(jìn)程慢。近日，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研人員利用基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)了一步法創(chuàng)制核不育系與為該不育系配套的保持系的技術(shù)，為第三代作物雜交育種技術(shù)提供了高效的技術(shù)方案。
2020年7月8日， Molecular Plant在線發(fā)表了中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院題為Genome Editing Enables Next-Generation Hybrid Seed Production Technology 的研究論文，報(bào)道利用基因編輯技術(shù)一步法同時(shí)創(chuàng)制作物隱性核不育系（GMS）與操控型核不育性保持系（MGM保持系）的技術(shù)體系。在該技術(shù)體系中，MGM保持系可同時(shí)生產(chǎn)GMS不育系與MGM保持系自身，從而實(shí)現(xiàn)了不依賴于自然GMS不育系的作物第三代雜交育種技術(shù)。
圖1.MGM保持系創(chuàng)制及其新一代雜交種生產(chǎn)技術(shù)原理示意圖
研究人員首先構(gòu)建與共轉(zhuǎn)化了MS26ΔE5-Editor和MGM兩個(gè)表達(dá)載體（圖1A、B），其中，MS26ΔE5-Editor為具有基因編輯活性的CRISPR/Cas9表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化的MS26ΔE5-Editor可對玉米內(nèi)源細(xì)胞核基因組編碼的雄花育性基因MS26進(jìn)行定點(diǎn)編輯，兩個(gè)定點(diǎn)DNA斷裂位點(diǎn)分別位于4號內(nèi)含子與非翻譯區(qū)（3’UTR），從而刪除了該基因的第5號外顯子，該外顯子中包括了決定雄花育性功能的細(xì)胞色素P450類血紅素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而創(chuàng)制出隱性核基因ms26ΔE5的GMS突變體；共轉(zhuǎn)化的MGM中包含了MS26育性恢復(fù)基因、導(dǎo)致雄配子失活的降解花粉淀粉體的淀粉酶基因、籽粒胚乳糊粉層特異紅色熒光基因3個(gè)串聯(lián)表達(dá)盒。其中，MGM中MS26育性互補(bǔ)表達(dá)盒采用MS26 內(nèi)源自身啟動(dòng)子與MS26-CDS序列，從而保證了MS26ΔE5-Editor基因刪除定點(diǎn)編輯機(jī)制對MGM上攜帶的MS26育性互補(bǔ)表達(dá)框編碼序列的沒有編輯活性，兩者兼容。再在被MS26ΔE5-Editor成功編輯得到內(nèi)源ms26ΔE5目標(biāo)突變的GMS突變系基礎(chǔ)上，篩選MS26ΔE5-Editor已被成功分離掉，但攜帶MGM載體的陽性植株，在進(jìn)一步鑒定MGM元件為單拷貝半合子的基礎(chǔ)之上，創(chuàng)制了MGM保持系。
圖2. MGM保持系繁殖的不育系開花期性狀（A）與結(jié)實(shí)籽粒實(shí)現(xiàn)了保持系與不育系種子無損分揀（B，C和D）與世代繁殖
MGM保持系上MS26-CDS表達(dá)盒賦予了植株具有孢子體雄花育性完全回復(fù)的表型；同時(shí)，50%單倍體雄配子體中攜帶MGM元件，MGM元件中的花粉失活表達(dá)盒為花粉特異（PG47啟動(dòng)子）驅(qū)動(dòng)的花粉淀粉體導(dǎo)肽定向的alpha淀粉酶（ZmAA1），該酶水解了雄配子細(xì)胞(花粉)中淀粉體中的淀粉，從而耗竭了這部分雄配子體能量供應(yīng)，致使這50%雄配子體徹底失活并失去育性，該活性使MGM元件僅能通過雌配子體向后代遺傳，形成MGM遺傳元件半合子（hemizygous）孢子體。因此，MGM保持系只可產(chǎn)生一半可育的花粉，該花粉不攜帶MGM元件（圖2A）；此外，MGM還攜有一個(gè)籽粒糊粉層細(xì)胞（Aleurone cell）特異表達(dá)的紅色熒光蛋白標(biāo)簽(DsRED)，致使保持系中通過雌配子產(chǎn)生的攜帶MGM的半合子種子帶有紅色熒光。因此，這個(gè)MGM保持系孢子體植株自交結(jié)實(shí)籽粒會產(chǎn)生一半的攜帶MGM元件的半合子保持系，這部分種子顯紅色熒光；另一半種子不攜帶MGM元件，為GMS不育系種子（圖2B），保持系自交產(chǎn)生的種子可分揀為帶紅色熒光的MGM保持系種子與無熒光的GMS不育系種子。研究還表明這種種子分揀信號可被肉眼與熒光分揀機(jī)器識別(圖2 C，D)，從而實(shí)現(xiàn)保持系與不育系種子的無損傷分揀；分揀得到的GMS不育系可用于雜交種制種生產(chǎn)，MGM保持系種子用于下一個(gè)生產(chǎn)年份的保持系和不育系的繁殖，如此反復(fù)，形成高效的第三代雜交種制種生產(chǎn)技術(shù)。
綜上所述，該技術(shù)大大提高了培育第三代作物雜交種的研發(fā)效率，可以高效地把目標(biāo)雜交種的母本轉(zhuǎn)變成MGM保持系，然后應(yīng)用于雜交種制種與親本繁殖。同樣的技術(shù)策略可以延伸用于其他細(xì)胞核育性基因和其他作物的雜交種生產(chǎn)。通過該技術(shù)體系生產(chǎn)的不育系和雜交種將不含有轉(zhuǎn)基因，是利用基因編輯技術(shù)快速進(jìn)行農(nóng)作物雜交育種的一個(gè)簡單、有效途徑。
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