精準(zhǔn)育種迭代突圍
來(lái)源： 瞭望 2024年第22期
?傳統(tǒng)育種方式成本高、工作量大，培育一個(gè)新品種往往需要耗時(shí)十年甚至更久。未來(lái)利用智能設(shè)計(jì)育種能夠加速迭代育種周期，有望3～5年培育出新品種
?我國(guó)基因編輯生物育種技術(shù)的基礎(chǔ)研究水平處于世界前列，但基因編輯的產(chǎn)業(yè)化尚處于起步階段
?相比統(tǒng)計(jì)模型，AI模型預(yù)測(cè)作物表型的準(zhǔn)確率平均提升15%以上，預(yù)測(cè)穩(wěn)定性提升5%
文 |《瞭望》新聞周刊記者 扈永順
基因組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)、合成生物學(xué)、基因編輯等生命科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，以及AI、大數(shù)據(jù)等技術(shù)的突破，帶動(dòng)了農(nóng)作物育種向分子設(shè)計(jì)、基因編輯為代表的4.0時(shí)代邁進(jìn)，最終將在AI、生物技術(shù)與信息技術(shù)“AI+BT+IT”融合下實(shí)現(xiàn)品種智能精準(zhǔn)設(shè)計(jì)。
基因是決定農(nóng)作物性狀的核心要素。農(nóng)作物的株高、果實(shí)大小、顏色、產(chǎn)量、抗病性和抗逆境能力等，都是由其遺傳物質(zhì)中的特定基因或者基因組合所控制的，因此了解清楚作物基因是進(jìn)行分子設(shè)計(jì)、基因編輯育種的前提。近年來(lái)我國(guó)在優(yōu)異種質(zhì)資源挖掘、水稻基因組研究、主要農(nóng)作物基因圖譜繪制、基因編輯工具研制等方面取得了系列成就，支撐了育種4.0時(shí)代的到來(lái)。
伴隨AI技術(shù)的廣泛應(yīng)用，智能設(shè)計(jì)育種曙光已現(xiàn)。近日，全球植物科學(xué)頂尖期刊《分子植物》刊載了中國(guó)科學(xué)家的最新研究，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家南繁研究院李慧慧研究組與達(dá)摩院（湖畔實(shí)驗(yàn)室）聯(lián)合研發(fā)出智慧育種平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了育種數(shù)據(jù)管理和分析、計(jì)算加速、AI預(yù)測(cè)親本及優(yōu)良品種的育種全流程整合。這表明，在AI、大數(shù)據(jù)等技術(shù)加持下，智能精準(zhǔn)設(shè)計(jì)育種邁出由理論到現(xiàn)實(shí)的關(guān)鍵一步。
受訪專家表示，傳統(tǒng)育種方式成本高、工作量大，培育一個(gè)新品種往往需要耗時(shí)十年甚至更久。未來(lái)利用智能精準(zhǔn)設(shè)計(jì)育種能夠加速迭代育種周期，有望3～5年培育出新品種，為種業(yè)強(qiáng)國(guó)建設(shè)提供技術(shù)支撐。
挖出特異基因
在精準(zhǔn)育種時(shí)代，借助現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)發(fā)掘能夠滿足現(xiàn)代育種需求的關(guān)鍵基因，對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定評(píng)價(jià)，已經(jīng)成為種業(yè)創(chuàng)新重要發(fā)展方向，一個(gè)基因成就一個(gè)產(chǎn)業(yè)正成為現(xiàn)實(shí)。
在目前精準(zhǔn)育種的技術(shù)手段中，分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)被廣泛應(yīng)用。這項(xiàng)技術(shù)結(jié)合了分子遺傳學(xué)、生物技術(shù)和傳統(tǒng)育種策略，通過(guò)檢測(cè)與目標(biāo)性狀緊密關(guān)聯(lián)的DNA分子標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)基因或數(shù)量性狀位點(diǎn)的直接選擇。相較傳統(tǒng)育種具有效率高、準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)。
“通過(guò)分子標(biāo)記可以檢測(cè)到水稻種子中耐鹽基因的存在，進(jìn)而聚合利用這些基因改良或選育出海水稻品種，實(shí)現(xiàn)在鹽堿灘涂上種水稻，保障我國(guó)糧食安全。”青島海水稻研究發(fā)展中心技術(shù)研發(fā)事業(yè)部部長(zhǎng)萬(wàn)吉麗介紹，他們還采用分子標(biāo)記輔助育種，實(shí)現(xiàn)了對(duì)糯性、生育期、香味、育性等多種性狀的鑒定。
中國(guó)水稻研究所研究員張光恒則帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)培育富含伽馬氨基丁酸（GABA）的巨大胚功能型水稻。“通過(guò)分子標(biāo)記前期介入，在兩個(gè)或多個(gè)親本雜交后代的分離群體中，提取苗期植株DNA，利用調(diào)控水稻富含GABA基因的分子標(biāo)記，篩選鑒定帶有該功能基因的水稻幼苗，與后期綜合性狀鑒定相結(jié)合，可以在較小的遺傳后代群體中快速篩選獲得一批不同遺傳背景的功能稻新品系（品種）。”
從育種技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看，分子標(biāo)記只能對(duì)個(gè)別位點(diǎn)開(kāi)展輔助育種，要滿足未來(lái)精準(zhǔn)育種的需要，還需深入挖掘優(yōu)異基因、解析關(guān)鍵基因功能，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行基因克隆實(shí)現(xiàn)基因聚合定向改良或選育新品種。
我國(guó)科學(xué)家在水稻基因組測(cè)序、注釋和功能基因挖掘方面走在世界前列，完成了高質(zhì)量的水稻基因組參考序列構(gòu)建，并分離克隆了一系列具有代表性的水稻關(guān)鍵功能基因，為解析水稻復(fù)雜農(nóng)藝性狀提供了重要基礎(chǔ)，這些成果對(duì)于提高水稻產(chǎn)量、抗逆性和品質(zhì)至關(guān)重要。
例如，水稻株型是決定水稻產(chǎn)量的主要因素之一，利用基因塑造水稻理想株型是提高水稻產(chǎn)量的重要途徑。此前李家洋院士團(tuán)隊(duì)分離鑒定出了水稻理想株型的主效基因IPA1，研究發(fā)現(xiàn)IPA1發(fā)生突變后，會(huì)使水稻分蘗數(shù)減少，穗粒數(shù)和千粒重增加，同時(shí)莖稈變得粗壯，增加了抗倒伏能力。實(shí)驗(yàn)顯示，將突變后的基因?qū)氤Ｒ?guī)水稻品種，可以使其產(chǎn)量增加10％以上。
李家洋介紹，IPA1能使水稻向理想株型發(fā)展，在高產(chǎn)育種中具有重要應(yīng)用前景，已應(yīng)用于培育嘉優(yōu)中科系列水稻新品種。例如嘉優(yōu)中科6號(hào)于2017年通過(guò)國(guó)家品種審定委員會(huì)審定，具有超高產(chǎn)、早熟、抗倒和低直鏈淀粉含量等優(yōu)點(diǎn)。生產(chǎn)試驗(yàn)平均畝產(chǎn)783.0千克，比對(duì)照增產(chǎn)16.3%。
再如，干旱是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要不良因素之一，發(fā)掘旱稻的優(yōu)異抗旱基因，對(duì)于稻作抗旱分子育種具有重要意義。此前由于缺乏對(duì)旱稻分化遺傳基礎(chǔ)的深入理解，利用旱稻這一抗旱生態(tài)資源發(fā)掘的抗旱基因還很少，限制了稻作抗旱分子育種進(jìn)程。直到2021年，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院李自超教授團(tuán)隊(duì)克隆了一個(gè)新的抗旱基因DROT1，鑒定出DROT1的抗旱優(yōu)異基因型并揭示了其起源與演化規(guī)律。
李自超告訴記者，該抗旱基因已經(jīng)獲得國(guó)家發(fā)明專利，并經(jīng)第三方評(píng)估機(jī)構(gòu)評(píng)估價(jià)值超100億元，被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定為是具有重大育種價(jià)值的基因。
通過(guò)系統(tǒng)的收集和分析，我國(guó)科學(xué)家已經(jīng)挖掘出了一批優(yōu)異的農(nóng)作物種質(zhì)資源及其特有的基因，為實(shí)現(xiàn)抗病蟲(chóng)、耐除草劑、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、資源高效利用等分子設(shè)計(jì)育種提供了重要基因資源。
解析基因遺傳網(wǎng)絡(luò)
作物性狀通常由多個(gè)基因決定，如作物的高度、產(chǎn)量、抗病性或耐逆性可能受到多個(gè)基因的共同調(diào)控?？茖W(xué)家將控制性狀的主效基因或由多個(gè)基因構(gòu)成并可進(jìn)行遺傳操作的功能單元定義為遺傳網(wǎng)絡(luò)。但由于多個(gè)基因組成的網(wǎng)絡(luò)變量過(guò)多，尋找、確認(rèn)這些基因并厘清其相互作用在很長(zhǎng)一段時(shí)間里都是科學(xué)難題。
近年來(lái)我國(guó)科研人員做了大量基礎(chǔ)研究，在作物高通量基因挖掘、網(wǎng)絡(luò)解析支撐分子設(shè)計(jì)育種方面不斷深入，水稻、小麥、玉米、大豆等主要作物復(fù)雜基因組學(xué)研究取得突破，復(fù)雜農(nóng)藝性狀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)持續(xù)深入，為分子設(shè)計(jì)育種提供理論支撐。
2013年，國(guó)家自然科學(xué)基金委啟動(dòng)了“主要農(nóng)作物產(chǎn)量性狀的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析”重大研究計(jì)劃，全面解析主要農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育重要生物學(xué)過(guò)程的分子遺傳及生理生化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在持續(xù)10年的資助下，科研人員解析了主要農(nóng)作物株型發(fā)育和籽粒形成的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，建立了主要農(nóng)作物產(chǎn)量性狀分子設(shè)計(jì)育種理論，為我國(guó)主要農(nóng)作物高產(chǎn)品種培育提供理論和技術(shù)支撐。
該重大研究計(jì)劃指導(dǎo)專家組秘書(shū)、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)教授賴錦盛向記者介紹，以挖掘玉米高產(chǎn)基因?yàn)槔?，為找到調(diào)控玉米穗行數(shù)關(guān)鍵基因，研究人員首先鎖定候選基因KRN2，發(fā)現(xiàn)其對(duì)穗行數(shù)具有負(fù)調(diào)控作用，通過(guò)多年多點(diǎn)的田間試驗(yàn)、表型分析發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，KRN2敲除突變體的穗行數(shù)、穗粒數(shù)、穗粒重等產(chǎn)量相關(guān)性狀均有所提高，產(chǎn)量比野生型提高10%左右。隨后，研究人員通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)方法最終確定是由于KRN2上游非編碼區(qū)在玉米馴化和改良過(guò)程中受到選擇導(dǎo)致其表達(dá)量降低，從而提高了玉米的穗行數(shù)。研究人員還針對(duì)這些基因成功解析穗行數(shù)形成的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為基因間區(qū)參與數(shù)量性狀的精細(xì)調(diào)控提供了新的證據(jù)。
再如，研究人員基于多基因聚合策略，設(shè)計(jì)出一個(gè)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)水稻新組合。中國(guó)科學(xué)院院士錢前帶領(lǐng)課題組將水稻品種“日本晴”和“9311”作為優(yōu)良目標(biāo)基因供體，主動(dòng)對(duì)28個(gè)優(yōu)良目標(biāo)基因進(jìn)行設(shè)計(jì)，涉及產(chǎn)量、稻米外觀品質(zhì)、蒸煮食味品質(zhì)和生態(tài)適應(yīng)性等，研究結(jié)果將推動(dòng)作物傳統(tǒng)育種向高效、精準(zhǔn)、定向的分子設(shè)計(jì)育種轉(zhuǎn)變。
據(jù)介紹，通過(guò)實(shí)施該重大研究計(jì)劃，研究人員對(duì)理想株型和籽粒發(fā)育調(diào)控機(jī)理有了較為明確的認(rèn)識(shí)，完成了228個(gè)調(diào)控株型和籽粒發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵新基因的克隆與功能解析，發(fā)現(xiàn)了株型和籽粒發(fā)育等產(chǎn)量性狀形成的新機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)展原創(chuàng)分子設(shè)計(jì)育種，培育出了25個(gè)國(guó)審和省審新品種。如今，我國(guó)水稻、玉米等主要農(nóng)作物株型和籽粒發(fā)育等方面研究的國(guó)際影響力顯著提升，并實(shí)現(xiàn)了“部分領(lǐng)跑”。
清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副教授劉俊杰（中）指導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作（2024 年 1 月 15 日攝） 清華大學(xué)供圖
開(kāi)發(fā)自己的“基因剪刀”
不同于分子設(shè)計(jì)育種注重通過(guò)優(yōu)化基因組合來(lái)培育新品種，基因編輯則是從基因“源頭”出發(fā)，側(cè)重于直接對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行編輯，高效率實(shí)現(xiàn)個(gè)性化和定向性狀改良。長(zhǎng)期以來(lái)，基因編輯技術(shù)的核心專利被少數(shù)國(guó)家掌控，為打破壟斷，我國(guó)也較早布局了基因編輯技術(shù)研究，大量企業(yè)和科研單位紛紛加入這一賽道，相關(guān)成果實(shí)現(xiàn)了與國(guó)際先進(jìn)水平“并跑”。
“農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的基因編輯技術(shù)，我國(guó)相關(guān)研究成果不斷打破壟斷，與國(guó)際先進(jìn)水平處于并駕齊驅(qū)的狀態(tài)。”中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所副研究員和玉兵介紹。和玉兵的觀點(diǎn)得到了多位受訪專家的認(rèn)同，隨著我國(guó)實(shí)驗(yàn)室育種技術(shù)迅速發(fā)展，技術(shù)更新?lián)Q代速度加快，與國(guó)外先進(jìn)基因編輯技術(shù)水平相比已不分伯仲。
例如，“基因剪刀”CRISPR-Cas9是國(guó)外研究團(tuán)隊(duì)掌握的重要基因編輯工具。它是一種能夠精準(zhǔn)剪切生物體DNA的基因編輯核酸酶Cas蛋白，研究人員利用“基因剪刀”可以對(duì)種子基因進(jìn)行修改、刪除、替換或插入等操作，能夠去除或減弱不利于農(nóng)藝性狀的基因，同時(shí)還可以增強(qiáng)對(duì)農(nóng)作物有益的基因，它能夠大幅縮短改良作物品種所需的時(shí)間，在農(nóng)作物育種領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
近年來(lái)，我國(guó)眾多高校院所和企業(yè)科研人員奮起直追投入“基因剪刀”研發(fā)工作。2021年中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物基因組與生物信息學(xué)系教授賴錦盛等科研人員成功研發(fā)出基因編輯新型底盤核酸酶Cas12i和Cas12j兩把“基因剪刀”，填補(bǔ)了中國(guó)在基因編輯底盤工具領(lǐng)域的技術(shù)空白，打破了國(guó)外技術(shù)壟斷。目前，Cas12i和Cas12j已獲得中國(guó)內(nèi)地、中國(guó)香港地區(qū)專利授權(quán)及日本專利授權(quán)。
為滿足基因編輯多樣性和個(gè)性化需求，國(guó)內(nèi)科研人員正在開(kāi)發(fā)新型非CRISPR基因編輯工具。例如，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所研究員高彩霞團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了突破CRISPR限制的模塊化結(jié)構(gòu)的堿基編輯新系統(tǒng)——CyDENT，該系統(tǒng)是不依賴CRISPR的全新堿基編輯工具，對(duì)農(nóng)作物精準(zhǔn)分子育種具有重要潛在應(yīng)用價(jià)值；2024年2月，清華大學(xué)生命學(xué)院劉俊杰課題組在《科學(xué)》（Science）報(bào)道了一種催化性RNA（核酶）—HYER（水解型內(nèi)切核酶），有望成為繼CRISPR之后新一代的基因編輯底盤工具。
總體上看，我國(guó)基因編輯生物育種技術(shù)的基礎(chǔ)研究水平處于世界前列，但應(yīng)認(rèn)識(shí)到我國(guó)基因編輯的產(chǎn)業(yè)化尚處于起步階段。當(dāng)前全球已有680多種基因編輯產(chǎn)品，包括耐除草劑水稻、無(wú)融合生殖水稻、抗白粉病小麥、糯性玉米、抗旱玉米、高油酸大豆等，我國(guó)尚未進(jìn)行基因編輯品種商業(yè)化種植。
為打破基因編輯技術(shù)“研究領(lǐng)先、管理滯后、應(yīng)用空白”的局面，2022年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了《農(nóng)業(yè)用基因編輯植物安全評(píng)價(jià)指南（試行）》，對(duì)農(nóng)業(yè)基因編輯植物的安全評(píng)價(jià)管理進(jìn)行了規(guī)范。為增強(qiáng)該指南的可操作性，2023年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布了《農(nóng)業(yè)用基因編輯植物評(píng)審細(xì)則（試行）》，進(jìn)一步明確基因編輯植物的分類標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)審內(nèi)容，指導(dǎo)基因編輯植物的安全管理工作。
基因編輯產(chǎn)業(yè)發(fā)展之路已經(jīng)鳴響發(fā)令槍，以山東舜豐生物科技有限公司為代表的產(chǎn)業(yè)界形成了“基因剪刀”家族。2022年，舜豐生物首次開(kāi)放基因編輯核心技術(shù)授權(quán)通道，實(shí)現(xiàn)了我國(guó)基因編輯核心技術(shù)的出口。2023年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布《2023年農(nóng)業(yè)用基因編輯生物安全證書(shū)（生產(chǎn)應(yīng)用）批準(zhǔn)清單》，舜豐生物摘得全國(guó)首個(gè)植物基因編輯安全證書(shū)，標(biāo)志著我國(guó)基因編輯正式駛?cè)氘a(chǎn)業(yè)化快車道。
AI打敗“開(kāi)盲盒”
作為加入AI元素的育種4.0進(jìn)階版，智能精準(zhǔn)設(shè)計(jì)育種正為種業(yè)創(chuàng)新帶來(lái)無(wú)限想象空間。
連日來(lái)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所研究員李慧慧帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)在南繁科研育種基地內(nèi)收集和分析1000份水稻材料生長(zhǎng)的表型信息。這1000份水稻材料并非隨機(jī)挑選種植的，而是智慧育種平臺(tái)給出的最優(yōu)答案。
李慧慧向記者介紹，如果用341份水稻親本培育新品種，由于親本的高產(chǎn)、抗病能力各不相同，兩兩結(jié)合后能夠培育出5.6萬(wàn)份性狀各異的后代，如果用這5.6萬(wàn)份水稻材料培育新品種，例如找出其中的高產(chǎn)、抗病等優(yōu)異性狀，需要把這5.6萬(wàn)份材料全都種在地里等生長(zhǎng)出水稻后觀測(cè)表型進(jìn)行篩選，這一理論方法如果落地實(shí)施，要耗費(fèi)巨大人力物力，傳統(tǒng)做法通常是隨機(jī)挑選部分材料種植，但這樣就降低了培育出理想型品種的幾率。
李慧慧通過(guò)與達(dá)摩院（湖畔實(shí)驗(yàn)室）聯(lián)合研發(fā)出智慧育種平臺(tái)，將341份水稻親本的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)輸入平臺(tái)后，通過(guò)AI算法預(yù)測(cè)親本的功能篩選出了性狀表現(xiàn)最好的前1000份材料，這1000份材料就成為培育新品種的最優(yōu)親本材料。此外，智慧育種平臺(tái)還有挖掘基因的功能，如果再將這1000份材料進(jìn)行田間種植，收集提取株高、葉綠素、穗數(shù)等表型數(shù)據(jù)，與基因測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)照，就能夠找出優(yōu)異表型的對(duì)應(yīng)基因。
通過(guò)基因分析預(yù)測(cè)表型、通過(guò)AI模型挖掘優(yōu)異基因，這就是智慧育種平臺(tái)加速育種進(jìn)程、為育種帶來(lái)無(wú)限想象空間的AI智慧育種。該智慧育種平臺(tái)引入多種大數(shù)據(jù)計(jì)算、AI模型、自動(dòng)化處理模塊。
達(dá)摩院智慧育種科學(xué)家顧斐介紹，基因組是由ATCG四種堿基組成的螺旋結(jié)構(gòu)，一粒水稻種子全基因組長(zhǎng)度超過(guò)4億個(gè)堿基。如果要找出導(dǎo)致兩粒水稻呈現(xiàn)不同表型的基因變異位點(diǎn)，就要將這兩粒水稻的全基因組進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算每個(gè)位置的堿基是否相同，如果相同就要剔除，計(jì)算量巨大。而智慧育種平臺(tái)將變異位點(diǎn)計(jì)算速度提高了110倍。
智慧育種平臺(tái)還通過(guò)全基因組數(shù)據(jù)、全基因組選擇算法訓(xùn)練了預(yù)測(cè)作物表型的AI模型。傳統(tǒng)預(yù)測(cè)模型是統(tǒng)計(jì)學(xué)家用統(tǒng)計(jì)的算法構(gòu)建的統(tǒng)計(jì)模型，用統(tǒng)計(jì)模型預(yù)測(cè)作物表型，預(yù)測(cè)穩(wěn)定性和精準(zhǔn)性都不高。利用深度學(xué)習(xí)的代表算法之一——卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，將基因數(shù)據(jù)與表型適配后輸入進(jìn)行訓(xùn)練，可以得出模型，利用該模型只需要輸入一粒種子的基因數(shù)據(jù)就能夠得到更準(zhǔn)確的表型預(yù)測(cè)結(jié)果。相比統(tǒng)計(jì)模型，AI模型預(yù)測(cè)作物表型的準(zhǔn)確率平均提升15%以上，預(yù)測(cè)穩(wěn)定性提升5%。
該智慧育種平臺(tái)能夠縮短世代間隔加快育種進(jìn)程，預(yù)計(jì)未來(lái)3～5年內(nèi)就能夠培育出新品種。目前該平臺(tái)已被全球23家科研機(jī)構(gòu)用于育種研究，包括中國(guó)水稻研究所、中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所、國(guó)際畜牧研究所、荷蘭瓦格寧根大學(xué)等?！?/span>
