DNA身份鑒定 解密品種“黑匣子” |
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《 農(nóng)民日報 》（ 2015年06月01日 06 版） 編者按針對目前我國農(nóng)作物品種身份鑒定手段落后、套牌侵權(quán)、珍貴種質(zhì)資源流失等問題，農(nóng)業(yè)部辦公廳于近日印發(fā)了《農(nóng)作物品種DNA身份鑒定體系構(gòu)建實施方案》，將在已有種質(zhì)資源庫基礎(chǔ)上，構(gòu)建全國統(tǒng)一的品種DNA信息數(shù)據(jù)庫及品種身份查詢平臺，實現(xiàn)品種身份可鑒定、信息可查詢、資源可保護、材料可流通、成果可交易、種子可追溯。品種管理的DNA鑒定模式由此開啟。 |
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鏈接 第一，全基因組測序并不適合直接用于品種鑒定中。品種鑒定主要是尋找樣品間差異的過程，在全基因組水平上，品種間甚至物種間絕大部分堿基序列是相同的，如人類與靈長類全基因組序列98%以上核苷酸相同，DNA序列中無差異的部分對于品種區(qū)分沒有實際意義。 第二，基因組測序，僅針對某個基因組如葉綠體基因組、線粒體基因組以及外顯子區(qū)測序等方法也不適合用于品種鑒定中。 第三，基于第二代測序技術(shù)進行SNP基因分型方法，或者利用Nimblegen序列捕獲芯片技術(shù)，設(shè)計探針捕獲到目的SNP區(qū)域片段，在基于測序技術(shù)檢測基因型。隨著測序技術(shù)的發(fā)展和成本的降低，機遇測序技術(shù)檢測SNP的方法具有一定發(fā)展?jié)摿Α?/p> DNA指紋鑒定技術(shù)的發(fā)展歷程？ 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展，品種鑒定技術(shù)從形態(tài)鑒定進入到DNA指紋技術(shù)水平。品種指紋鑒定技術(shù)發(fā)展經(jīng)歷了3個重要階段：20世紀(jì)90年代的第一代標(biāo)記技術(shù)RELP（限制性片段長度多態(tài)性）和PARD（隨機擴增多態(tài)性），21世紀(jì)初興起的第二代標(biāo)記技術(shù)SSR（簡單重復(fù)序列），近幾年啟動研究的第三代標(biāo)記技術(shù)SNP（單核苷酸多態(tài)）。其中，SSR和SNP被UPOV的BMT分子測試指南推薦作為品種鑒定和數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的優(yōu)選標(biāo)記。 采用不同器官組織提取DNA對品種鑒定有無影響？ DNA指紋技術(shù)通過鑒別不同品種間遺傳物質(zhì)DNA的堿基組分、排列順序不同，從而區(qū)分不同品種。對于一個玉米品種而言，從其種子、幼苗、葉片、苞葉中提取的DNA代表了該品種的基因組序列特征，對DNA指紋鑒定的結(jié)果準(zhǔn)確性不會產(chǎn)生任何影響；但從雜交種種子果皮上提取的DNA和從雜交制種天母本植株所結(jié)的果穗籽粒提取的DNA并不能代表該品種的基因組序列特征，會嚴(yán)重影響該品種的DNA指紋鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性。 品種分子監(jiān)測與轉(zhuǎn)基因檢測有何異同？ 相同之處是應(yīng)用的技術(shù)手段基本相同。 不同之處，一是品種真實性及純度鑒定的分子檢測是對品種的整體遺傳背景的監(jiān)測，具體選用的引物位點因所鑒定的物種不同而不同；轉(zhuǎn)基因檢測是對目的基因的監(jiān)測，具體引物位點的選擇因所鑒定的基因而不同，與物種無關(guān)。二是兩種檢測項目在實驗污染控制方面是不同的，造成污染的原因也不同。種子真實性和純度檢測污染主要出現(xiàn)在樣品準(zhǔn)備階段，環(huán)境中的外源核酸一般不會對其檢測結(jié)果產(chǎn)生影響；而轉(zhuǎn)基因檢測主要污染出現(xiàn)在PCR擴增階段，環(huán)境中的外源核算容易導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性。 ——摘編自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社《玉米品種DNA指紋鑒定技術(shù)100問》 |
給種子做個“親子鑒定” ●DUS田間表型鑒定是對申請保護的植物新品種進行特異性、一致性和穩(wěn)定性的栽培鑒定試驗或室內(nèi)分析測試的過程。測試方法是將申請品種與近似品種在相同的生長條件下，從植物的種子、幼苗、開花期、成熟期等各個階段對多個質(zhì)量性狀、數(shù)量性狀及抗病性等作出觀察記載，并與近似品種進行結(jié)果比較。 ●DNA室內(nèi)基因型鑒定是一項生物學(xué)檢測技術(shù)，以玉米為例，玉米有總數(shù)約為30億個堿基對的DNA，每個品種的DNA都不完全相同，品種與品種之間不同的堿基對數(shù)目達幾百萬之多，因此通過分子生物學(xué)方法顯示的DNA圖譜也有差異，由此可以識別不同的品種。 本報記者繆翼李國龍 如果將100個品種撕掉標(biāo)簽和包裝，通過種子形態(tài)或者田間種植進行形態(tài)觀察讓它們一一對號入座，辨別出分別是什么品種，我想幾乎沒有人能夠做到，那成千上萬個品種就更不可能做到了。但利用DNA指紋技術(shù)識別這些品種就輕而易舉了，一天就可以完成。“這就是DNA鑒定技術(shù)既準(zhǔn)確可靠，又經(jīng)濟快捷的優(yōu)勢。”北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心主任趙久然的信心來自于他們團隊20余年持之以恒的關(guān)于玉米標(biāo)準(zhǔn)DNA技術(shù)的研究與應(yīng)用。 農(nóng)業(yè)部辦公廳日前發(fā)布了《農(nóng)作物品種DNA身份鑒定體系構(gòu)建實施方案》，明確了農(nóng)作物品種DNA身份鑒定體系構(gòu)建的重要意義和發(fā)展方向。 且說快和準(zhǔn) 難以想象僅2014年一年時間里，玉米中心做過的DNA指紋檢測鑒定樣本量達1萬多份。“正常程序是7個工作日之內(nèi)出結(jié)果，加急樣品48小時內(nèi)出結(jié)果。”檢測中心王鳳格博士說，“無論是已審定的、參加過區(qū)試的，還是提交品種權(quán)保護的品種，凡是在玉米中心做過檢測的，其‘指紋’和痕跡就會永久留存了。目前，這個標(biāo)準(zhǔn)指數(shù)庫已經(jīng)保存了2萬多個玉米標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋信息，未來還會進一步擴容。” 人類DNA鑒定技術(shù)的應(yīng)用也有近20年了，通過人的DNA檢測可以進行親子鑒定，更可以用于刑事偵查中的DNA比對，已經(jīng)成為公安機關(guān)有效的破案利器。作物與人都屬于生物，遺傳信息載體都是DNA，很多技術(shù)是相通的，但也有不同之處。趙久然解釋，在人類DNA檢測結(jié)果判別上，引入最大似然率概念，就是說兩個樣本的DNA鑒定結(jié)果完全一樣，也存在著極小概率不是同一個人的可能性。而在玉米品種判定中，沒有使用“最大似然率”這個概念，采用了“高度近似”這個概念。就是說如果兩個品種的DNA鑒定結(jié)果相同，其判定結(jié)論是“相同或高度近似”，有可能不同，但即使有些許差異，這種差異也是很小的，頂多屬于派生品種范疇。如果把兩個品種種在一起，連育種者自己都分不清哪個是他育成的品種，還能說那是一個新品種嗎？“同”是相對的，“不同”是絕對的，沒有兩個絕對相同完全一樣的事物，關(guān)鍵是確定和把握好尺度。 |
遏制“仿冒套” 有人說“市場上至少1/3的種子是假冒的。”有人感慨“新品種培育六七年，仿冒才幾天。”業(yè)內(nèi)認為“仿冒套”傷的是種業(yè)創(chuàng)新力，呼吁通過DNA身份鑒定這項技術(shù)支撐，能夠?qū)?ldquo;仿冒套”起到遏制作用，鼓勵真正的品種創(chuàng)新，引導(dǎo)市場走向自律。 人靠相貌等可以辨別，而DNA鑒定是最終途徑。農(nóng)作物也是一樣，由于少數(shù)具備高產(chǎn)、廣適、抗病等特性的親本被集中應(yīng)用，在原品種基礎(chǔ)上稍作修改的派生品種越來越多，品種間的遺傳差異是肉眼所難以辨別的，這時就需要DNA來鑒定其身份了。 例如山東濟南中院受理先鋒公司告某公司生產(chǎn)的“費玉3號”侵犯“先玉335”品種權(quán)案，經(jīng)玉米中心DNA檢測，“費玉3號”與農(nóng)業(yè)部“先玉335”標(biāo)準(zhǔn)樣品比較，在40個位點上位點差異為1，被告未提出有利證據(jù)證明不是同一品種，判決被告停止侵權(quán)并賠償原告經(jīng)濟損失。 “依據(jù)玉米DNA指紋檢測標(biāo)準(zhǔn)，如果差異位點數(shù)≥2，證明為不同品種；差異位點數(shù)≤1，則證明品種相同或高度近似。”趙久然說，“這其中是留有框量的，但是基本不給‘仿冒套’鉆空子的余地。” 不是隨便“抓一把” 玉米有30億個堿基對，憑什么僅靠目前的40個位點檢測結(jié)果，就能判斷清楚？ 對此，趙久然說，這40個位點不是隨便“抓一把”。2001年起確立了核心引物組合法的品種鑒定方案，從2001年~2005年，經(jīng)過4年多系統(tǒng)篩選和重新設(shè)計，形成了一套共40個位點適于玉米品種鑒定的SSR（簡單重復(fù)序列）引物組合，這些位點都存在等位基因，在不同品種間存在著明確的差異，這些差異組合就可以組合出巨大的天文數(shù)字。在此基礎(chǔ)上研制出國內(nèi)首個和唯一的適合玉米品種真實性檢測的的DNA指紋復(fù)合擴增試劑盒專利產(chǎn)品。利用這套引物，僅玉米中心就開展了近5萬份樣品的真實性檢測，充分檢驗了40個引物的有效性。 SNP（單核苷酸多態(tài)性）技術(shù)是否就此取代了SSR技術(shù)在DNA身份鑒定測試中的應(yīng)用？ “實際上是推廣一代，研究一代。”趙久然說，每種標(biāo)記技術(shù)都在特定時期內(nèi)對品種檢測工作發(fā)揮一定作用，其中SSR和SNP由于均為共顯性遺傳、染色體定位清楚、具有高通量自動化的潛力而被UPOV的BMT分子測試指南推薦作為品種鑒定和數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的優(yōu)選標(biāo)記。趙久然認為，兩種標(biāo)記技術(shù)均是比較適合品種指紋分析的標(biāo)記，其中SSR標(biāo)記可以滿足大部分樣品快速低成本的進行真實性檢測的要求，而SNP標(biāo)記可以對其中鑒別困難的派生品種進行精細鑒別，兩種標(biāo)記技術(shù)各自具備優(yōu)缺點，可優(yōu)勢互補，未來將長期并存應(yīng)用。 |
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盧洪 國務(wù)院2011年8號文件把種業(yè)定義為國家基礎(chǔ)性、戰(zhàn)略性核心產(chǎn)業(yè)，種業(yè)安全是我國糧食安全的重要保障。為了進一步激發(fā)種業(yè)科技創(chuàng)新活力，創(chuàng)建公平競爭的市場環(huán)境，加強種質(zhì)資源保護、品種權(quán)保護與管理，按照《國務(wù)院辦公廳關(guān)于深化種業(yè)體制改革提高創(chuàng)新能力的意見》的要求，急需構(gòu)建適應(yīng)現(xiàn)代需求的以玉米為代表的農(nóng)作物品種DNA身份鑒定體系。 同時，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的不斷進步，尤其是近年來基因組學(xué)的發(fā)展，使利用基因組學(xué)的研究成果進行玉米品種管理和種子質(zhì)量檢驗已經(jīng)成為可能。另外，移動互聯(lián)、大數(shù)據(jù)引發(fā)的產(chǎn)業(yè)變革，為品種管理向田間表型身份鑒定與室內(nèi)基因型身份鑒定相結(jié)合的方向發(fā)展提供了有力的技術(shù)支撐?，F(xiàn)代種業(yè)的發(fā)展對品種管理的數(shù)字化、便捷化、智能化提出了更高的要求，可以看出，構(gòu)建以玉米為代表的主要農(nóng)作物品種DNA身份鑒定體系構(gòu)建具有非常重要的意義。 近20年來，以基因組學(xué)，高通量DNA測序技術(shù)和生物信息學(xué)為代表的現(xiàn)代生物技術(shù)科學(xué)獲得了突飛猛進的發(fā)展，這些技術(shù)為建設(shè)以SNP檢測為基礎(chǔ)的新一代DNA身份鑒定體系打下了堅實的基礎(chǔ)。因此，建設(shè)新一代玉米DNA身份鑒定體系從技術(shù)上已經(jīng)完全成熟。 具體來講，新一代玉米DNA身份鑒定體系主要包括針對3種不同類型資源-品種身份鑒定、育種材料確權(quán)、種質(zhì)資源評價分別建立SNP鑒定標(biāo)準(zhǔn)。具體工作包括： 篩選適用于品種身份鑒定、育種材料確權(quán)、種質(zhì)資源評價的不同檢測目的的SNP位點組合。根據(jù)解決品種身份鑒定、育種材料確權(quán)、種質(zhì)資源評價3類不同鑒定內(nèi)容，分別制定SNP位點篩選原則、位點數(shù)目、位點組合等。 制定玉米品種SNP身份鑒定、育種材料確權(quán)、種質(zhì)資源評價的檢測技術(shù)規(guī)范。借鑒國際做法，依托SNP技術(shù)，在DNA樣品制備、檢測平臺選擇、結(jié)果表述、判定閾值等問題分別進行研究，制定適用于玉米品種身份鑒定、育種材料確權(quán)、種質(zhì)資源評價3類不同目的的SNP分子標(biāo)記檢測技術(shù)規(guī)范。 玉米品種DNA身份鑒定體系技術(shù)驗證。由全國農(nóng)技中心、農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心分別組織相關(guān)檢測機構(gòu)、DUS測試中心等單位對玉米DNA身份鑒定位點組合和技術(shù)規(guī)范進行多實驗室間驗證。技術(shù)驗證方案：制定和分發(fā)統(tǒng)一的技術(shù)操作規(guī)范、結(jié)果報告格式和驗證樣品，在不同實驗室之間對利用相同位點組合構(gòu)建SNP指紋數(shù)據(jù)的一致性驗證，對品種鑒定結(jié)果的一致性驗證。由項目主持單位匯總提交驗證總結(jié)報告，全國農(nóng)技中心、科技發(fā)展中心對提交的報告進行比對、分析及驗收。 建立玉米品種DNA身份信息數(shù)據(jù)庫及品種身份查詢平臺。依據(jù)制定的技術(shù)規(guī)范，建立玉米品種DNA身份信息數(shù)據(jù)庫包括育成品種、育種材料、種質(zhì)資源三大類樣品的DNA身份信息。玉米DNA指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建需重點研究確定指紋質(zhì)量保證和數(shù)據(jù)庫管理使用問題，同時解決不同分子標(biāo)記技術(shù)、不同檢測技術(shù)（芯片技術(shù)、測序技術(shù)、熒光掃描技術(shù)、電泳技術(shù)等）數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)格式不同的問題，實現(xiàn)數(shù)據(jù)可整合共享。 （作者系中玉金標(biāo)記北京生物技術(shù)股份有限公司總裁） |
SNP檢測可實現(xiàn)全程自動化 張健 國以農(nóng)為本，農(nóng)以種為先。培育和生產(chǎn)優(yōu)良的種子是種業(yè)的核心任務(wù)，而我國目前的種業(yè)市場存在品種間同質(zhì)化嚴(yán)重、套牌侵權(quán)泛濫、種子質(zhì)量良莠不齊等問題，育種單位間的種質(zhì)資源難以正常流動，但育種材料流失依然嚴(yán)重，這些問題嚴(yán)重制約著我國現(xiàn)代種業(yè)的發(fā)展。解決這些問題的根本在于對種質(zhì)資源、育種材料和作物品種進行有效保護，從DNA水平上對農(nóng)作物品種和材料進行鑒定是實施品種保護的基礎(chǔ)。 目前，SNP檢測作為最新的分子標(biāo)記檢測方法，已被眾多國際組織，如國際種子檢驗協(xié)會（ISTA）、國際植物新品種保護聯(lián)盟（UPOV）、國際種子聯(lián)盟（ISF）等，推薦為DNA水平上品種鑒定的方法。杜邦先鋒、孟山都和先正達等國際一流農(nóng)業(yè)公司也都采用了SNP標(biāo)記對內(nèi)部的育種材料和不同品種進行分類鑒定。農(nóng)業(yè)部最近印發(fā)的《農(nóng)作物品種DNA身份鑒定體系構(gòu)建實施方案》也標(biāo)志著我國DNA水平上的品種鑒定將實施采用SNP技術(shù)。 我們知道，不同人在基因水平上是有很大差異的。同樣，同一作物的不同品種在DNA水平上也有很多差異，SNP是由單個核苷酸（A,T,C,G）的改變而引起的DNA序列的變化。例如在一個品種中某一位點上的核苷酸是A，但在另一品種中則變成了T，這種單核苷酸水平上的變化可以穩(wěn)定遺傳，并能通過一定手段被準(zhǔn)確檢測。品種之間也有不少位點存在著這樣的穩(wěn)定差異，通過比較不同的SNP位點就可有效區(qū)分不同的品種和育種材料。 目前常用的SNP檢測方法有3種： 高通量SNP檢測。用PCR的方法特異擴增目標(biāo)位點，在反應(yīng)體系中加上能區(qū)分SNP型的熒光引物或探針，反應(yīng)完成后通過檢測熒光信號就可以判斷該SNP位點上核苷酸類型。這種檢測方法已經(jīng)非常成熟，全程可使用自動化技術(shù)，檢測過程無需人為干預(yù)，因而具有成本低、可重復(fù)性高、快速準(zhǔn)確可靠等特點，非常適合對大量樣本的SNP檢測。華智水稻生物技術(shù)有限公司引進的LGCSNPLine系統(tǒng)和道格拉斯的ArrayTape系統(tǒng)即屬于該類，可迅速檢測幾百到幾萬份樣本中的SNP位點。 SNP芯片技術(shù)。將大量的SNP探針固定在一張芯片上，將品種樣本DNA與芯片雜交，通過采集芯片上的熒光信號，可一次檢測該品種中成千上萬個SNP位點。目前市面上已有Affymetrix和Illumina公司提供SNP芯片和相應(yīng)設(shè)備。比較而言，SNP芯片技術(shù)檢測一個樣本的成本較高。 測序檢測。該方法通過對全基因組或目標(biāo)位點擴增后進行測序，直接讀取相關(guān)位點的核苷酸堿基類型，從而可檢測出不同品種間的SNP位點差異。該方法能產(chǎn)生大量的序列數(shù)據(jù)，可能發(fā)現(xiàn)一些未知的DNA變異，但需要專業(yè)的生物信息分析，目前成本相對比較高，技術(shù)的成熟度也不如前兩種。 高通量SNP檢測方法對DNA樣本的質(zhì)量要求不高，可使用全自動設(shè)備提取的DNA樣本，操作簡捷快速。SNP檢測過程全程自動化操作，無需開蓋操作，不僅結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性高，還能降低人工和試劑的成本，其功能類似于識別品種身份的“讀卡器”。 （作者系華智水稻生物技術(shù)有限公司總經(jīng)理） |
